田園青 張悅鳳 王彩麗

(天津市海河醫(yī)院，天津 300350)

IgA 腎病(IgA nephropathy，IgAN)是以反復(fù)發(fā)作性肉眼血尿或鏡下血尿，腎小球系膜區(qū) IgA 沉積或以 IgA 沉積為主要特征的原發(fā)性腎小球疾病[1]。大部分觀點(diǎn)認(rèn)為IgA在系膜沉積，活化補(bǔ)體，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，該病與黏膜感染(呼吸道、腸道等)有關(guān)，與免疫和遺傳因素亦有一定相關(guān)性，可發(fā)生在任何年齡，伴有不同程度的蛋白尿、高血壓和腎臟功能受損，是導(dǎo)致終末期腎臟病的常見原發(fā)性腎小球疾病 。

IgAN是最常見的與6q22-23相關(guān)的腎小球腎炎[2]，是一種多基因疾病，人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)位于人類第 6 號(hào)染色體短臂 6p21.3區(qū)域，有研究認(rèn)為系膜增生性IgAN與HLA-DRB1 基因多態(tài)性相關(guān)[3]。非肌性肌球蛋白重鏈9基因(Myosin heavy chain 9,nonmuscle,MYH9)位于人染色體22q12.3，被證實(shí)與非裔美國人慢性腎臟病相關(guān)[4,5](Chronic kidney disease，CKD)，包括局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥[4,5](Focal segmental glomerular sclerosis，F(xiàn)SGS)、糖尿病(2型)腎病[6]、C1q腎病[7]和高血壓腎損害[5]等。本文通過PCR技術(shù)探討MYH9Rs4821480位點(diǎn)基因多態(tài)性與病理、預(yù)后關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對象 IgAN組：腎穿刺活檢診斷為IgAN患者148例,并隨訪。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 外周靜脈血提取DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，MYH9基因總序列(chromosome:NCBI36:22:35006673:35114558:-1)上游引物5′-GCCACACAGAACAGAAAGC-3′，下游引物5′-GGCTGGCATTTAGTGTTGG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物440 bp，酶切位點(diǎn)A、T。擴(kuò)增條件： 94℃預(yù)變性180 s，94℃變性35 s，55℃退火45 s，72℃延伸55 s，共30個(gè)循環(huán)。72℃終末延伸10 min。酶切體系： PCR產(chǎn)物10 μl, DraⅠ內(nèi)切酶0.5 μl、緩沖液2 μl、雙蒸水7.5 μl,370℃ 溫育箱過夜(12～13 h)，2%瓊脂糖4.0 g/dl溴乙錠凝膠方法電泳(電壓120 V,20 min)，紫外透射自動(dòng)成像分析儀上進(jìn)行成像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independenttest)和單項(xiàng)方差分析(One-Way ANOVA),計(jì)數(shù)、等級(jí)資料比較采用χ2檢驗(yàn)(Chi-Square test)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗(yàn)，多因素生存分析采用Cox模型，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 PCR擴(kuò)增目的片段440 bp，酶切：①TT純合子，300 bp；②GT雜合子，440 bp、300 bp；③GG純合子，440 bp(圖1)。

2.2病理指標(biāo)比較 計(jì)量資料腎病理免疫熒光IgA、C3，病理Hass分級(jí)在三種基因型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、2)。

2.3基因型對腎功能影響分析 根據(jù)CCR水平(CCR<60 ml/min以及CCR≥60 ml/min)分組后作為應(yīng)變量，將發(fā)病時(shí)年齡、基因型、Haas分級(jí)、血壓、蛋白尿程度等分別賦值作為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。結(jié)果表明年齡是腎臟損害加重的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.012,OR=1.375)(表3)，基因型則與腎功能進(jìn)展無關(guān)。

圖1 基因型產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of genotypic productsNote: M.Marker(150 bp，240 bp，400 bp)；1，2.TT(300 bp)；3，4.GT(440 bp，300 bp)；5，6.GG(440 bp).

2.4基因型與預(yù)后的相關(guān)性分析 對148例患者進(jìn)行隨訪，以腎穿為零點(diǎn)，CCr<15 ml/min或SCr增倍為終點(diǎn)事件。進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析整體比較(圖2)。TT基因型下降明顯(表4)；基因型組兩兩比較，GG基因型與TT基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)。

圖2 Kaplan-Meier生存分析Fig.2 Kaplan-Meier survival analysisNote: X10=Genotype，1=GG，n=14，2=GT n=39，3=TT n=3.

表1計(jì)量資料描述性比較

Tab.1Descriptivecomparisonofmeasurementdata

Measurement data GenotypeGG(n=30)GT(n=107)TT(n=11)Pathological immunofluorescence IgA2.48±0.672.70±0.672.63±0.52Pathological immunofluorescence C31.86±0.991.89±1.141.75±0.89

Note：One-way ANOVA analysisP>0.05.

表2等級(jí)資料比較

Tab.2Gradedatacomparison

Count grade dataGenotypeGGGTTTSex Male16527 Female14554Hematuria No493 Yes26755Hass pathological grade Level 1,210306 Level 3,4,52074524 proteinuria <1 g5253 ≥1 g 2067724 h proteinuria<1 g52531 g≤24 h proteinuria<3.5 g1244324 h proteinuria≥3.5 g8234

Note：Chi-Square test，P>0.05.

表3Logistic回歸統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Tab.3Logisticregressionstatistics

Variable(B)(S.E.)WaldSig.Exp(B)95%CI for Exp(B)LowerUpperAge1.3360.5346.2700.0121)3.8041.33710.827Sex0.4260.6300.4580.4981.5320.4465.263Blood pressure0.4120.6980.3480.5551.5100.3845.935Urine protein0.6440.4462.0830.1491.9050.7944.570Hematuria 0.9620.6282.3470.1262.6170.7648.963HASS0.2820.3010.8790.3481.3250.7352.389Genotype0.3190.6060.2770.5991.3750.4194.509

Note：1)P=0.012<0.05.The confidence interval for correcting the regression coefficient 95% does not contain 1.

表4生存分析描述

Tab.4Survivalanalysisdescription

GenotypeNumber of each groupNumber of events atthe end pointCensored value (truncated value)Number of casesPercentage (%)GG1421285.7GT3973282.1TT32133.3Total56114580.4

表5生存時(shí)間兩兩比較

Tab.5Comparisonofsurvivaltime

GenotypeGGχ2(Log-Rank)PGTχ2(Log-Rank)PTTχ2(Log-Rank)PGG0.6890.4064.1060.0431)GT0.6890.4063.6200.057TT4.1060.0431)3.6200.057

Note：1)P<0.05.

表6Cox模型篩選的危險(xiǎn)因素及參數(shù)估計(jì)

Tab.6RiskfactorsandparameterestimationofCoxmodelscreening

VariableBSEWaldSig.Exp(B)95.0% CI for Exp(B)LowerUpperAge-12.4066.1924.0140.0451)0.0000.0000.764Sex-1.6352.9830.3000.5840.1950.00167.473Blood pressure-2.0513.8310.2860.5920.1290.000234.736Urine protein-5.8257.2700.6420.4230.0030.0004 551.996Hematuria -3.4143.3181.0580.3040.0330.00021.979HASS-2.6101.1455.1950.0231)0.0740.0080.694CCR-4.6871.8016.7700.0091)0.0090.0000.315Genotype0.3704.8800.0060.9401.4470.00020 639.818

Note：1)P<0.05.

多因素對預(yù)后影響采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析，將對預(yù)后有影響的可能危險(xiǎn)因素：發(fā)病年齡、CCR水平、蛋白尿程度、血壓、Haas分級(jí)、不同基因型等分別賦值作為自變量，得出結(jié)論：發(fā)病時(shí)年齡、CCR水平、Hass分級(jí)是影響腎病患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表6)。

3 討論

IgAN是由法國Berger于1968年首次提出的一種原發(fā)性腎小球疾病，最早認(rèn)為預(yù)后良好，經(jīng)過40余年研究發(fā)現(xiàn)，IgAN是一種慢性進(jìn)展性疾病，20%～40%進(jìn)展為終末期腎病，該病是由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎，共同特征是免疫熒光下見到IgA在系膜區(qū)或伴沿毛細(xì)血管壁沉積[8]，可合并IgG、IgM及補(bǔ)體沉積。不同種類的免疫球蛋白沉積與臨床表現(xiàn)及組織損傷程度之間有一定的關(guān)系。單純IgA型組織損傷程度較輕，合并IgG及/或IgM沉積者,易合并補(bǔ)體沉積,提示其結(jié)合補(bǔ)體能力較單純IgA沉積強(qiáng),因此造成腎組織相應(yīng)損傷也較重,IgG、IgM及補(bǔ)體的沉積,可能參與IgAN的發(fā)生和發(fā)展[9]。然而迄今為止未找到與IgA抗體起反應(yīng)的抗原物質(zhì)，但治療上仍以抑制補(bǔ)體活化治療該病。IgAN臨床表現(xiàn)和預(yù)后多種多樣[10]，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，疾病進(jìn)展速度與性別、年齡、是否合并腎性高血壓、尿蛋白程度均有一定的相關(guān)性，其中尿蛋白水平與 IgAN進(jìn)展最為密切，其治療時(shí)應(yīng)用激素或免疫抑制劑等也一定程度上參考蛋白尿水平，降低 IgA腎病患者的蛋白尿可以改善預(yù)后[11]。

IgAN腎活檢病理變化多樣，輕者光鏡下腎小球、腎小管基本正常，重者腎小球出現(xiàn)嚴(yán)重壞死性病變、新月體形成；腎小球硬化和腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化[12]，發(fā)展為臨床終末期腎病(ESRD)。不同病理分型的IgAN預(yù)后差異很大[13]。病理學(xué)家提出多種分類方法，但有一定局限性，未能獲得廣泛認(rèn)同。目前較廣泛的IgAN分級(jí)系統(tǒng)包括WHO組織學(xué)分類法、Lee、Hass 分類法。目前國際上還沒有一個(gè)分級(jí)系統(tǒng)廣為臨床和病理醫(yī)生所接受，對各種病理改變的臨床意義還缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，各個(gè)分級(jí)之間也很難達(dá)成一致。 國際 IgAN協(xié)作組和腎臟病理學(xué)會(huì)于2009 年建立了牛津病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。牛津病理分型方法強(qiáng)調(diào) IgAN常見的病理指標(biāo)，容易評(píng)估，較客觀反映腎活檢腎臟病變的動(dòng)態(tài)變化，具有高度可重復(fù)性[14]，具備了將不同中心、不同病理醫(yī)師所得病理結(jié)果進(jìn)行比較的基礎(chǔ)，各個(gè)病理指標(biāo)與 IgAN臨床指標(biāo)獨(dú)立相關(guān)[15]。但牛津分型是回顧性研究，病例選擇存在偏倚，中國病例數(shù)偏少，其合理程度及可操作性需進(jìn)一步驗(yàn)證。 Hass 分型屬于描述性分級(jí)，有研究結(jié)果提示 Hass分型級(jí)數(shù)越高，臨床腎功能越差，分級(jí)結(jié)果與臨床實(shí)驗(yàn)室的檢查吻合度較高[16]。Hass 與 WHO分級(jí)方法的一致性較好[17]。結(jié)合以上，我們選擇Hass分級(jí)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

腎小球機(jī)械屏障濾孔由內(nèi)層是毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞、中層是非細(xì)胞性的基膜、外層是腎小球的上皮細(xì)胞組成，上皮細(xì)胞具有足突細(xì)胞，相互交錯(cuò)的足突之間形成裂隙。裂隙上有一層濾過裂隙隔膜，是濾過的最后一道屏障。足突細(xì)胞及其相關(guān)的裂孔膜蛋白在蛋白尿發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，受到國內(nèi)外的重視[18]，Ghiggeri等[19]研究發(fā)現(xiàn)個(gè)體MYH9基因突變，腎活檢電鏡表現(xiàn)為局灶足細(xì)胞足突消失，足細(xì)胞裂孔隔膜缺失，足細(xì)胞受損。MYH9基因編碼非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA (Nonmusclemyosin heavy chain ⅡA ,NMMHC-ⅡA) ，分子量約220 kD，主要在腎小球(特別是足細(xì)胞)、腎小管和小管周圍毛細(xì)血管表達(dá),在近曲小管呈彌散分布，定位于腎小球足細(xì)胞和系膜細(xì)胞異常肌球蛋白聚集、破壞足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞骨架，導(dǎo)致腎臟疾病進(jìn)展， 有研究發(fā)現(xiàn)正常腎組織中 MYH9 不表達(dá)[20]。

但是我們通過研究MYH9基因Rs4821480位點(diǎn)基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)其基因型與IgAN病理HASS分級(jí)、病理指標(biāo)、蛋白尿、鏡下血尿無關(guān)，考慮原因?yàn)樵撐稽c(diǎn)基因突變對足細(xì)胞的影響較小，但這只是推測，有待于加大樣本量進(jìn)一步研究。對隨訪患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析比較，TT基因型下降明顯，生存時(shí)間比較，GG基因型與TT因型有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明T等位基因可能引起腎功能惡化。這說明該基因多態(tài)性可能與腎臟疾病相關(guān)，直接導(dǎo)致腎臟疾病進(jìn)展[4,5]。

IgAN的臨床病程與預(yù)后極不平衡，研究認(rèn)為大量蛋白尿與血肌酐升高是不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，若IgAN表現(xiàn)為腎病綜合征、大量蛋白尿，或伴隨腎性高血壓，新月體形成，那么預(yù)后極為不佳，同時(shí)，嚴(yán)重的腎小球硬化與間質(zhì)纖維化是病程進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)該基因位點(diǎn)年齡、CCR、Hass分級(jí)與IgAN預(yù)后有關(guān)，與既往研究相同，但是MYH9基因該位點(diǎn)基因型與預(yù)后無明顯相關(guān)。 近期也有研究發(fā)現(xiàn)該基因SNP 并未見與ESRD有顯著關(guān)聯(lián)[22]，該研究結(jié)果與我國其他研究相似[23]需加大樣本量及隨訪量進(jìn)一步研究。