甘永雄 俞 鳳

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥 230022)

短時(shí)間大量失血引起的全身多器官功能衰竭是導(dǎo)致失血性休克患者死亡的主要原因[1]。其中，腎臟是最易受累的器官之一[2,3]。研究表明，炎癥反應(yīng)和線粒體功能障礙參與了失血性休克誘導(dǎo)腎臟損傷的過(guò)程[4-6]。NLRP3炎癥小體激活是介導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)的主要因素[7]。抑制NLRP3炎癥小體的活化可減輕慢性腎病小鼠的腎纖維化和線粒體功能紊亂，還可促進(jìn)失血性休克大鼠的腎功能的恢復(fù)[7,8]。因此，尋找新的藥物及方法抑制NLRP3炎癥小體的活化將有利于失血性休克后腎臟功能的修復(fù)。五味子甲素是從五味子中提取的一類(lèi)木質(zhì)素類(lèi)成分，具有抗凋亡及免疫調(diào)節(jié)等作用，同時(shí)還具有較強(qiáng)的抗炎活性[9-11]。研究表明，五味子甲素可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體激活抑制IL-1β的分泌和線粒體ROS的釋放[12]。但五味子甲素是否能通過(guò)調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活減輕失血性休克誘導(dǎo)的腎損傷還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文將通過(guò)復(fù)制失血性休克模型探究五味子甲素對(duì)失血性休克大鼠腎臟損傷的作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 五味子甲素購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司。血肌酐(Serum creatinine,Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Caspase-1一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，HRP標(biāo)記的IgG山羊抗小鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。IL-1β、TNF-α和GAPDH引物由上海生工設(shè)計(jì)合成。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型的建立 實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重220～280 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、五味子甲素20 mg/kg組、五味子甲素40 mg/kg組和五味子甲素80 mg/kg組，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道方法復(fù)制大鼠失血性休克模型。除對(duì)照組外，其他組大鼠用水合氯醛麻醉后，分離左側(cè)股動(dòng)脈和股靜脈并插入導(dǎo)管，股靜脈導(dǎo)管連接灌注泵以隨時(shí)補(bǔ)充液體，股動(dòng)脈導(dǎo)管用于失血處理，放血量約為全身的60%左右。同時(shí)分離左側(cè)股動(dòng)脈，用導(dǎo)管連接RM6240BD生物信號(hào)采集系統(tǒng)以連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓力，血壓控制在35～40 mmHg，維持1.5 h后進(jìn)行復(fù)蘇。對(duì)照組大鼠除不做失血處理外，其他處理同上。完成模型復(fù)制后，五味子甲素20 mg/kg組、五味子甲素40 mg/kg組和五味子甲素80 mg/kg組大鼠即刻腹腔注射給予相應(yīng)濃度的五味子甲素，對(duì)照組和模型組給予等量溶媒，24 h后取靜脈血及腎臟組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2試劑配制 精密稱(chēng)取8 g五味子甲素溶于10 ml生理鹽水中配制成0.8 g/ml的五味子甲素母液，用前稀釋?zhuān)⒂敏燃谆w維素鈉助溶，使其終濃度不超過(guò)0.5%。

1.2.3試劑盒檢測(cè) 給予五味子甲素24 h后，靜脈取血，并以3 500 r/min轉(zhuǎn)速4℃離心15 min，取上層血清根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中Scr、BUN的含量。

1.2.4線粒體提取及檢測(cè) 用水合氯醛麻醉大鼠后，取腎臟并快速分離去除結(jié)締組織和脂肪組織，將分離后的組織放入預(yù)冷的線粒體分離緩沖液中，并剪碎至1 mm。隨后用含5%BSA的線粒體分離緩沖液進(jìn)行勻漿，過(guò)濾除去組織殘?jiān)筇荻入x心提取線粒體，再用緩沖液重懸沉淀，并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)加入顯色劑，檢測(cè)吸光度，計(jì)算蛋白含量。最后用試劑盒檢測(cè)線粒體中SDH、SOD和GSH-Px的活性。

1.2.5qRT-PCR 用試劑盒提取組織總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)所用到引物均由上海生工設(shè)計(jì)合成。其引物序列如下：IL-1β上游引物：5′-GCAACTGTTCCTGAA-CTCAACT-3′，下游引物：5′-ATCTTTTGGGGTCCGT-CAACT-3′；TNF-α上游引物：5′-TTCGGAACTCACTGGATCCC-3′，下游引物：5′-GGAACAGTCTGGGAA-GCTCT-3′；GAPDH 上游引物：5′-TGACCACAGTCCATGCCATC-3′，下游引物：5′-GACGGACACATTGGGGGTAG-3′。

1.2.6Western blot 提取腎皮質(zhì)總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)總蛋白濃度并調(diào)平。10% SDS-PAGE分離各組蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜2 h，隨后滴加Caspase-1 (1∶1 000)一抗，于4℃封閉過(guò)夜。第二天棄去一抗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗室溫封閉1 h后滴加ECL顯色液進(jìn)行曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1五味子甲素對(duì)大鼠腎臟功能的影響 為了探究五味子甲素對(duì)失血性休克大鼠腎臟功能的影響，我們檢測(cè)了各組大鼠血清中Scr和BUN的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清BUN和Scr的含量明顯升高(P<0.01,P<0.001,圖1)；五味子甲素40 mg/kg組和五味子甲素80 mg/kg組大鼠血清BUN和Scr的含量較模型組比較明顯降低(P<0.05,P<0.01,圖1)，表明五味子甲素可促進(jìn)失血性休克大鼠腎臟功能的恢復(fù)。

2.2五味子甲素對(duì)腎臟線粒體功能的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，失血性休克能顯著降低大鼠腎臟線粒體SDH、SOD和GSH-Px的活性(P<0.05,圖2)；五味子甲素(80 mg/kg)可明顯升高失血性休克大鼠SDH、SOD和GSH-Px活性(P<0.05,圖2)，表明其可促進(jìn)失血性休克大鼠線粒體功能的恢復(fù)。

2.3五味子甲素對(duì)腎臟炎癥反應(yīng)的影響 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠腎臟皮質(zhì)IL-1β和TNF-α的mRNA水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)；五味子甲素80 mg/kg組大鼠IL-1β和TNF-α的mRNA水平較模型組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)，同時(shí)，五味子甲素還能顯著降低模型大鼠腎臟IL-1β和TNF-α的蛋白表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01，圖4)，表明其可抑制失血性休克大鼠腎臟炎癥反應(yīng)。

圖1 五味子甲素對(duì)大鼠腎臟功能的影響Fig.1 Effect of Sch A on renal function of model ratsNote: n=8,**.P<0.01,***.P<0.001 vs control group;#.P<0.05,##.P<0.01 vs model group.

圖2 五味子甲素對(duì)腎臟線粒體功能的影響Fig.2 Effect of Sch A on mitochondrial function of kidneyNote: n=8,*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.Each experiment was repeated at least three times.

圖3 五味子甲素對(duì)IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of Sch A on mRNA levels of IL-1β and TNF-αNote: n=8,*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

2.4五味子甲素對(duì)NLRP3炎癥小體活化的影響 為了探究五味子甲素對(duì)NLRP3炎癥小體活化的作用，我們采用Western blot法檢測(cè)了NLRP3炎癥小體活化標(biāo)記因子Caspase-1的蛋白表達(dá)水平。模型組大鼠Caspase-1的表達(dá)水平較正常組比較顯著升高(P<0.05,圖5)；五味子甲素 40 mg/kg組和五味子甲素 80 mg/kg組Caspase-1的蛋白表達(dá)水平與模型組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01,圖5)。結(jié)果表明，五味子可抑制失血性休克大鼠NLRP3炎癥小體的活化。

圖4 五味子甲素對(duì)IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of Sch A on protein levels of IL-1β and TNF-αNote: The protein levels were determined by Western blot.GAPDH was used as losding control.n=8,*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05,##.P<0.01 vs model group.

圖5 五味子甲素對(duì)NLRP3炎癥小體活化的影響Fig.5 Effect of Sch A on activation of NLRP3 inflammasomeNote: n=8,*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05,##.P<0.01 vs model group.

3 討論

腎損傷是失血性休克的常見(jiàn)并發(fā)癥[2,3]。腎損傷早期主要是短暫的腎臟功能改變，若不能及時(shí)恢復(fù)血流供應(yīng)將會(huì)導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)缺血性壞死，最終導(dǎo)致腎臟器質(zhì)性病變[14]，但腎血流灌注急劇增加也會(huì)進(jìn)一步加重腎損傷[15]。因此，尋找新的藥物促進(jìn)腎功能的恢復(fù)能有效挽救失血性休克患者的生命。本研究通過(guò)復(fù)制失血性休克大鼠模型探究五味子甲素對(duì)失血休克后大鼠血清中BUN和Scr含量的影響。結(jié)果顯示，失血性休克模型組大鼠血清BUN和Scr的含量明顯升高，表明失血性休克造成了大鼠腎臟功能損傷。五味子甲素可明顯降低失血性休克大鼠血清BUN和Scr的含量，提示其能緩解失血性休克后腎損傷，發(fā)揮腎保護(hù)作用。

線粒體功能障礙是導(dǎo)致失血性休克腎損傷的重要機(jī)制之一[4]。線粒體功能紊亂可導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生、能量供應(yīng)障礙及促細(xì)胞凋亡因子的大量分泌[16]。調(diào)控線粒體功能紊亂能有效減輕失血性休克誘導(dǎo)的腎損傷[17]。研究表明，白蛋白誘導(dǎo)的線粒體功能障礙可促進(jìn)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡[18,19]。中藥提取物白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)控失血性休克引起的線粒體功能紊亂抑制ROS的表達(dá)，減輕腎損傷[20,21]。同時(shí)，五味子可減輕順鉑引起的腎損傷[22]。五味子甲素可通過(guò)調(diào)控線粒體功能促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子甲素可顯著促進(jìn)失血性休克大鼠線粒體SDH、SOD和GSH-Px的活性，其中SDH是呼吸鏈的關(guān)鍵酶，SOD和GSH-Px可清除過(guò)氧化物，抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞存活，提示五味子甲素可通過(guò)調(diào)控線粒體功能障礙減輕失血性休克引起的腎損傷。

炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致是失血性休克腎損傷的另一重要機(jī)制，NLRP3炎癥小體是一種重要的炎癥反應(yīng)啟動(dòng)因子[24,25]。研究表明，線粒體功能紊亂可促進(jìn)NLRP3炎癥小體激活[18]。NLRP3炎癥小體的激活還可進(jìn)一步的促進(jìn)線粒體功能紊亂，抑制NLRP3炎癥小體的活化可減輕Ang II誘導(dǎo)的線粒體功能障礙[26]。此外，NLRP3炎癥小體可促進(jìn)Caspase-1活化，從而促進(jìn)炎癥因子IL-1β、TNF-α等的活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[27,28]。下調(diào)NLRP3炎癥小體活化能降低Caspase-1表達(dá)水平，因此，Caspase-1常被作為NLRP3炎癥小體活化的標(biāo)志[29]。研究表明，NLRP3炎癥小體在各類(lèi)腎病導(dǎo)致腎損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7,26]。同時(shí)，NLRP3也可通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進(jìn)失血性休克后多器官功能損傷[30,31]。Xiang等[32]的研究表明，在失血性休克肺損傷中，NLRP3炎癥小體可誘導(dǎo)通過(guò)誘導(dǎo)炎癥因子IL-β和ROS的釋放加重肺損傷。抑制NLRP3炎癥小體活化可抑制腎臟炎癥反應(yīng)，減輕失血性休克大鼠腎損傷[8]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，五味子甲素可顯著下調(diào)失血性休克大鼠腎臟IL-1β、TNF-α的mRNA水平，同時(shí)能明顯減弱失血性休克對(duì)Caspase-1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，提示五味子甲素可抑制失血性休克誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化，從而抑制炎癥因子的表達(dá)，減輕失血性休克大鼠腎臟炎癥反應(yīng)。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，失血性休克誘導(dǎo)的腎損傷可導(dǎo)致線粒體功能紊亂、誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化。五味子甲素可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的活化抑制失血性休克大鼠腎臟炎癥反應(yīng)、調(diào)控線粒體功能障礙，從而減輕失血性休克誘導(dǎo)的腎臟損傷。本研究?jī)H初步探討了五味子甲素對(duì)失血性休克誘導(dǎo)的腎損傷的作用，對(duì)于其作用機(jī)制還需進(jìn)行進(jìn)一步研究，從而為失血性休克早期腎損傷的治療提供新的潛力藥物。