王 靜

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院腫瘤科，襄陽(yáng) 441000)

乳腺癌是世界女性惡性腫瘤中最常見(jiàn)的疾病之一，據(jù)WHO國(guó)際癌癥研究中心調(diào)查顯示，2010年世界女性乳腺癌新發(fā)病例約占全部女性惡性腫瘤的23%，且每年死亡人數(shù)達(dá)50萬(wàn)，占所有女性死亡人數(shù)的1.8%[1]。近年來(lái)，隨著女性生活壓力的增加、生活節(jié)奏不斷加快，乳腺癌的發(fā)病率及死亡率逐年升高，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。當(dāng)前，化療法已成為乳腺癌患者的主要治療手段之一，但是患者對(duì)化療藥物尤其是蒽環(huán)類(lèi)藥物的耐藥性已嚴(yán)重影響療效，如何增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)可釋放大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，可通過(guò)激活癌基因方式誘發(fā)正常細(xì)胞癌變。已有研究顯示[4]，ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)可對(duì)多柔比星(Doxorubicin，Dox)治療人胰腺癌起到增敏作用，但關(guān)于NAC對(duì)Dox治療人乳腺癌的增敏作用鮮有研究，因此，本研究觀察NAC在Dox對(duì)MCF-7細(xì)胞株化療過(guò)程中的增敏作用，并初步探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，購(gòu)于上海生科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物 活性氧抑制劑NAC，Sigma公司，CAS號(hào)：616-91-1；鹽酸多柔比星注射液，輝瑞制藥(無(wú)錫)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20013334；規(guī)格：10 mg。

1.1.3主要試劑 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的連接素(Annexin-Fluorescein isothiocyanate，Annexin-FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、二甲基噻唑試劑盒(Dimethyl-2-thiazolyl，MTT)，廣州碧云天有限公司；Hoechst33342 PI熒光染料，Solarbio公司；無(wú)血清細(xì)胞凍存基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基)、胎牛血清，Gibco公司；2′，7′-二氯熒光素雙乙酸鹽(2′，7′-Dichlorodihydrofluorescin diacetate，DCFH-DA)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、Trizol，Sigma公司；ROS檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)兔抗人多克隆抗體(一抗)、Caspase-3、Bcl-2、Bax 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白(二抗)，Abcam公司。

1.1.4主要儀器 DMi8型倒置熒光顯微鏡、TCS-SP8型激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)徠卡公司；Multiskan GO型酶標(biāo)儀，Thermo公司；Cyto FLEX型流式細(xì)胞儀，Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 NAC用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)配置成300 mmol/L母液，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)前用PBS配置為10、30、60 mmol/L低、中、高3種濃度。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，購(gòu)于上海生科院細(xì)胞庫(kù)，以RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃、5%CO2恒定條件下常規(guī)培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，將細(xì)胞分裝于6孔板中，隨機(jī)分為5組，每組5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，Dox組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和對(duì)照組分別用0.4 μg/ml Dox、0.4 μg/ml Dox+(10、30、60 mmol/L)NAC、PBS進(jìn)行處理，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞凋亡率測(cè)定 收集培養(yǎng)至12、24、48 h的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，Hoechst33342 PI染料緩沖液重懸，嚴(yán)格根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定 收集培養(yǎng)至48 h的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/孔，嚴(yán)格按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，采用熒光探針標(biāo)記法檢測(cè)。加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液配置的濃度為3 μmol/L的DCFH-DA，37℃恒溫孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次后，加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡掃描攝像(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)，熒光強(qiáng)度用Zeiss LSM Image Examiner軟件進(jìn)行分析。

1.2.5Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平測(cè)定 收集培養(yǎng)至48 h的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，59℃退火20 s，72℃延伸60 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5～10 min，以β-actin作為內(nèi)參。采用凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量，以2-ΔΔCT為目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。Caspase-3：上游引物：5′-CATAGCTCTACTCTAGGCTATCGCT-3′，下游引物：5′-CATCCGGTCTGGTAGCCATCT-GCAG-3′；Bcl-2：上游引物：5′-ACTACCTAGTCAGAGCGTAGCTATG-3′，下游引物：5′-GCTGCTCGGAGAACTGTCGACCTTG-3′；Bax：上游引物：5′-GCACGGACTATCACTGTGAACAGCC-3′，下游引物：5′-ATCTATCGCTGCAGTTCGACACTATG-3′；β-actin：上游引物：5′-GTGTACGGTGCATGCCTACGTGAGA-3′，下游引物：5′-ACGGACTAGCGCTCTGTCTAGCGCA-3′。

1.2.6Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平測(cè)定 收集培養(yǎng)至48 h的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒步驟提取總蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定蛋白總量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳法分離，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用脫脂奶粉搖床封閉1 h，加入一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，加入二抗(1∶5 000)，常溫孵育1 h，暗室中曝光、顯色。應(yīng)用凝膠成像軟件掃描拍照，使用BandScan灰度值分析軟件分析，以Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7觀察指標(biāo) ①乳腺癌細(xì)胞凋亡率對(duì)比；②乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平對(duì)比；③Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)比；④Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌細(xì)胞凋亡率對(duì)比 乳腺癌細(xì)胞凋亡率，組間、時(shí)間及交互比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌細(xì)胞凋亡率組間比較，對(duì)照組最低、Dox組其次，低，高劑量組稍高，中劑量組最高，除低劑量組與高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他每?jī)山M間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組內(nèi)比較，除對(duì)照組隨時(shí)間變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他各組均隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

2.2乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平對(duì)比 乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ROS熒光強(qiáng)度組間比較，對(duì)照組最低、中劑量組其次，低、高劑量組稍高，Dox組最高，除低劑量組與高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他每?jī)山M間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2，圖2、3。

2.3Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)比 Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，對(duì)照組最高，Dox組其次，低、高劑量組稍低，中劑量組最低，除低劑量組與高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他每?jī)山M間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Caspase-3、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，對(duì)照組最低，Dox組其次，低、高劑量組稍高，中劑量組最高，除低劑量組與高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他每?jī)山M間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3、圖4。

圖1 凋亡率對(duì)比(%)Fig.1 Comparison of rate of apoptosis(%)

Groupsn12 h24 h48 hControl group58.60±1.319.37±1.0210.16±1.10Dox group521.10±3.501)36.75±3.711)5)48.91±5.011)5)6)Low dose group 535.46±4.161)2)48.08±4.901)2)5)66.07±4.231)2)5)6)Middle dose group551.37±5.251)2)3)65.79±6.121)2)3)5)84.04±5.791)2)3)5)6)High dose group537.80±4.601)2)4)50.11±5.211)2)4)5)68.53±4.611)2)4)5)6)FF inter group=21.209,F moments=41.067,F interactive=30.139PP inter group=0.000,P moments=0.000,P interactive=0.000

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the Dox group，2)P<0.05；compared with the low dose group，3)P<0.05；compared with the middle dose group，4)P<0.05；compared with 12 h，5)P<0.05；compared with 24 h，6)P<0.05.

Groupsn48 hControl group551.08±6.41Dox group5105.71±8.441)Low dose group 587.42±7.491)2)Middle dose group565.30±5.371)2)3)High dose group585.36±7.531)2)4)F88.202P0.000

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the Dox group，2)P<0.05；compared with the low dose group，3)P<0.05；compared with the middle dose group，4)P<0.05.

圖2 各組ROS熒光強(qiáng)度(×400)Fig.2 Ros fluorescence intensity of each group(×400)Note: A.Control group;B.Dox group;C.Low dose group;D.Middle dose group;E.High dose group.

圖3 細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度對(duì)比Fig.3 Contrast of intracellular ROS fluorescence intensity

GroupsnCaspase-3Bcl-2BaxControl group50.42±0.071.45±0.08e0.37±0.04efDox group50.73±0.081)1.28±0.121)5)0.50±0.051)5)6)Low dose group 50.91±0.101)2)1.06±0.101)2)5)0.69±0.071)2)5)6)Middle dose group51.32±0.161)2)3)0.72±0.081)2)3)5)0.88±0.081)2)3)4)5)High dose group50.95±0.061)2)4)0.96±0.091)2)4)5)0.71±0.061)2)4)5)6)F53.53044.19451.645P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the Dox group，2)P<0.05；compared with the low dose group，3)P<0.05；compared with the middle dose group，4)P<0.05.

圖4 Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expressions of Caspase-3, Bcl-2 and Bax mRNA

GroupsnCaspase-3Bcl-2BaxControl group50.97±0.091.53±0.105)0.51±0.065)6)Dox group51.19±0.091)1.35±0.121)5)0.62±0.071)5)6)Low dose group 51.32±0.101)2)1.13±0.101)2)5)0.80±0.051)2)5)6)Middle dose group51.59±0.131)2)3)0.86±0.081)2)3)5)1.22±0.101)2)3)5)6)High dose group51.35±0.101)2)4)1.18±0.091)2)4)5)0.83±0.081)2)4)5)6)F24.33132.18366.998P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the Dox group，2)P<0.05；compared with the low dose group，3)P<0.05；compared with the middle dose group，4)P<0.05.

2.4Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)比 Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，對(duì)照組最高,Dox組其次,低、高劑量組稍低,中劑量組最低，除低劑量組與高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他每?jī)山M間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，對(duì)照組最低，Dox組其次，低、高劑量組稍高，中劑量組最高，除低劑量組與高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他每?jī)山M間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3，圖5、6。

圖5 Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡圖Fig.5 Immunoblotting of Caspase-3，Bcl-2 and Bax protein

圖6 Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)比Fig.6 Relative expressions of Caspase-3, Bcl-2 and Bax protein

3 討論

乳腺癌發(fā)病病因與發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)因子、女性雌激素分泌紊亂、家族遺傳等因素有關(guān)[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)[8]，乳腺癌患者出現(xiàn)化療藥物耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的重要原因，產(chǎn)生多藥耐藥的機(jī)制主要有p-糖蛋白藥泵或細(xì)胞內(nèi)解毒相關(guān)蛋白酶異常高表達(dá)、抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)性質(zhì)改變等。原發(fā)性耐藥、化療后復(fù)治產(chǎn)生耐藥是影響化療藥物療效的重要原因，因此提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性對(duì)提高治療效果十分重要[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]，ROS大量產(chǎn)生后可通過(guò)氧化細(xì)胞內(nèi)特異性化學(xué)簇，導(dǎo)致DNA突變或者激活炎癥因子釋放途徑，最終可導(dǎo)致癌基因激活或抑制細(xì)胞正常凋亡程序的啟動(dòng)，控制腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS含量可有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞分化等過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡率組間比較，Dox組最低，低、高劑量組其次，中劑量組最高(P<0.05)；ROS熒光強(qiáng)度組間比較，對(duì)照組最低，中劑量組其次，低、高劑量組稍高，Dox組最高(P<0.05)；組內(nèi)比較各組乳腺癌細(xì)胞凋亡率均隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明30 mmol/L的NAC與Dox聯(lián)用促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS含量效果最佳，提示NAC可增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞對(duì)Dox化療敏感性。本研究中應(yīng)用NAC與化療藥物Dox聯(lián)用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平與宋瑤等[11]研究結(jié)果相符，在其研究中單用化療藥物組ROS陽(yáng)性表達(dá)率為(67.32±3.75)%，聯(lián)用組為(45.32±7.23)%，對(duì)照組為(25.32±3.20)%，證實(shí)NAC確實(shí)可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體中正常細(xì)胞可同多個(gè)信號(hào)途徑修復(fù)DNA損傷，抑制遺傳粗變發(fā)生，在具有癌變傾向的細(xì)胞中DNA修復(fù)功能失衡，DNA突變累積至一定水平時(shí)誘發(fā)癌變[12，13]。ROS是指產(chǎn)生于呼吸鏈中的一類(lèi)單電子高活性基團(tuán)[14]，可直接或間接啟動(dòng)過(guò)氧化作用，ROS在正常機(jī)體中含量穩(wěn)定，具有雙向調(diào)節(jié)作用，較低濃度ROS水平具有一定修復(fù)細(xì)胞損傷的功能，腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，利于其存活。本研究中應(yīng)用Dox化療時(shí)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高，應(yīng)用活性氧抑制劑NAC后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低至一定水平，腫瘤細(xì)胞凋亡率較單用Dox升高。由此可知，NAC在一定濃度范圍內(nèi)具有輔助Dox促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

此外，本研究中，Bcl-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，對(duì)照組最高，Dox組其次，低、高劑量組稍低，中劑量組最低(P<0.05)；Caspase-3、Bax mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，對(duì)照組最低、Dox組其次，低、高劑量組稍高，中劑量組最高(P<0.05)，提示NAC可增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞對(duì)Dox化療敏感性的調(diào)控機(jī)制可能是通過(guò)降低Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)，增強(qiáng)Caspase-3、Bax mRNA及蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。Caspase-3是Caspase蛋白酶家族的重要成員[15]，該蛋白酶在調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵酶作用，該蛋白酶一旦被激活，其下游一系列蛋白酶被激活，可通過(guò)激活細(xì)胞表面死亡受體途徑或線粒體途徑引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能異常，最終引起細(xì)胞死亡。Bcl-2家族廣泛存在于線粒體內(nèi)，可使線粒體膜電位增強(qiáng)，阻止線粒體內(nèi)Ca+釋放和核酸內(nèi)切酶激活，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用[16]。Bax是與Bcl-2相關(guān)的一類(lèi)蛋白，且與Bcl-2高度同源，該蛋白可直接激活Caspase-3，進(jìn)而激活死亡效應(yīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，同時(shí)抑制Bcl-2蛋白活性，發(fā)揮促凋亡作用[17，18]。由此，NAC在一定濃度范圍內(nèi)與Dox聯(lián)用可能通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而激活Bcl-2/Bax信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮促凋亡作用。

綜上所述，在一定范圍內(nèi)，NAC與Dox聯(lián)用可顯著促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS含量，可顯著增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞對(duì)Dox化療敏感性，其中30 mmol/L的NAC效果最佳，推測(cè)其增敏調(diào)控機(jī)制是通過(guò)降低Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)，增強(qiáng)Caspase-3、Bax mRNA及蛋白表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，且與Bcl-2 /Bax信號(hào)通路有關(guān)，為臨床中應(yīng)用NAC增強(qiáng)乳腺癌患者對(duì)化療藥物的敏感性提供理論基礎(chǔ)。