郗昌磊 龔治林 周啟昌 于 杰 葉 輝 曹龍磊 王沛云

(荊州市中心醫(yī)院肛腸外科,荊州 434020)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升的趨勢，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的復(fù)雜過程，涉及抑癌基因、癌基因、信號通路等的變化，研究引起結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制對于該病的診療具有重要意義[1]。HOXD10基因是同源異形盒基因家族中的一員，可通過對腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)而發(fā)揮抑癌作用[2]。有研究表明，在乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中HOXD10的表達(dá)減少，并在上皮來源的腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲中發(fā)揮重要作用[3,4]。而過表達(dá)HOXD10可降低鼻咽癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力[5]。HOXD10在結(jié)直腸癌中的研究相對較少，有研究顯示，結(jié)直腸癌中HOXD10的低表達(dá)與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系，miR-10b可通過靶向HOXD10促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲[6,7]，過表達(dá)HOXD10對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖凋亡、免疫的影響及機(jī)制研究得尚未清楚。本研究通過將過表達(dá)HOXD10的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞，旨在研究其對細(xì)胞增殖、凋亡、免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達(dá)及Notch信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Bibco；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen；pcDNA3.1真核表達(dá)載體購自天根生化有限公司；MTT試劑購自日本DOJINDO；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基；HOXD10、TGF-β1、VEGF、Notch1、Jagged1和Hes1抗體均購自美國SANTA CRUZ；酶標(biāo)儀購自上海拜格生物；流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人正常結(jié)腸NCM460細(xì)胞及結(jié)直腸癌HCT116、HT29、CaCO2細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d在6孔板的每孔中接種1×106個(gè)HT29細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)90%匯合時(shí)，參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，隨機(jī)將細(xì)胞分為三組，陽性轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.1-HOXD10組)取質(zhì)粒2 μg質(zhì)粒加入250 μl的DMEM培養(yǎng)基中，獲得A液，取4 μl的LipofectamineTM2000加入250 μl的DMEM培養(yǎng)基中獲得B液，室溫靜置5 min，混勻A液和B液，室溫靜置20 min，將混合液均勻的滴加在細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕晃動以使混合均勻，陰性對照組(pcDNA3.1組)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒2 μg，操作同pcDNA3.1-HOXD10組，同時(shí)設(shè)置加入原培養(yǎng)液的為空白對照組，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2蛋白質(zhì)印跡(Western blot) 采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法對蛋白濃度進(jìn)行檢測，取總蛋白40 μg上樣，經(jīng)12%的SDS-PAGE，電泳后將凝膠取出，轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的膜1 h，加入稀釋好的HOXD10、TGF-β1、VEGF、Notch1、Jagged1和Hes1抗體(皆為1∶1 000稀釋)，4℃搖床孵育過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果觀察。以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞活力 接種生長至對數(shù)期的HT29細(xì)胞(5×104個(gè)/ml)于96孔板，每孔中加入100 μl，常規(guī)培養(yǎng)過夜，按照1.2.1分組及方法轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，每孔加20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4 h停止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液棄去，加入150 μl的DMSO溶液在每個(gè)細(xì)胞孔中，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(OD值，570 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，500 μl的Binding緩沖液懸浮細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的Annexin V 5 μl，充分混勻后加入PI 5 μl，混勻后避光條件室溫反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌細(xì)胞HOXD10的表達(dá) HOXD10在結(jié)直腸癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)如圖1所示，結(jié)直腸癌HCT116、HT29、CaCO2細(xì)胞中HOXD10的表達(dá)均顯著低于在NCM460細(xì)胞表達(dá)(P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染效果 pcDNA3.1-HOXD10轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞48 h，Western blot檢測各組細(xì)胞HOXD10的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-HOXD10的HT29細(xì)胞HOXD10表達(dá)顯著高于空白對照組(P<0.05)，而pcDNA3.1組和空白對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 HOXD10在結(jié)直腸癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of HOXD10 in colorectal cancer cellsNote: A.HOXD10 protein expression electrophoresis map;B.HOXD10 protein relative expression quantity;compared with NCM460 cell,*.P<0.05.

2.3過表達(dá)HOXD10抑制HT29細(xì)胞活力 各組細(xì)胞活力檢測結(jié)果如圖3所示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXD10組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。

2.4過表達(dá)HOXD10誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果如圖4所示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXD10組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.5過表達(dá)HOXD10下調(diào)HT29細(xì)胞免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達(dá) 各組細(xì)胞中免疫抑制因子VEGF和TGF-β1的蛋白表達(dá)結(jié)果如圖5所示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXD10組VEGF和TGF-β1的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

圖2 pcDNA3.1-HOXD10轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞的效果Fig.2 Effect of pcDNA3.1-HOXD10 transfection on HT29 cellsNote: A.HOXD10 protein expression electrophoresis map;B.HOXD10 protein relative expression quantity;compared with blank control group,*.P<0.05.

圖3 過表達(dá)HOXD10對HT29細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of overexpression of HOXD10 on activity of HT29 cellsNote: Compared with the pcDNA3.1 group,*.P<0.05.

2.6過表達(dá)HOXD10下調(diào)HT29細(xì)胞Notch信號通路 Western blot檢測各組細(xì)胞Notch信號通路受體Notch1、配體Jagged1及下游靶基因Hes1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖6所示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXD10組Notch1、Jagged1和Hes1的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

圖4 過表達(dá)HOXD10對HT29細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of overexpression of HOXD10 on apoptosis of HT29 cellsNote: A.Flow cytometry results;B.Apoptosis rate of each group;compared with pcDNA3.1 group,*.P<0.05.

圖5 過表達(dá)HOXD10對HT29細(xì)胞免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達(dá)的影響Fig.5 Effect of over expression of HOXD10 on expression of VEGF and TGF-β1 in HT29 cellsNote: A.The expression of VEGF and TGF-β1 protein electrophoresis;B.The relative expression of VEGF and TGF-β 1；compared with pcDNA3.1 group,*.P<0.05.

圖6 過表達(dá)HOXD10對HT29細(xì)胞Notch信號通路的影響Fig.6 Effect of overexpression of HOXD10 on Notch signaling pathway in HT29 cellsNote: A.Protein expression electrophoresis map;B.Relative expression of protein;compared with pcDNA3.1 group,*.P<0.05.

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與其相關(guān)的抑癌基因、原癌基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)可用于診療結(jié)直腸癌的分子靶點(diǎn)，但仍需尋找更多有效的靶點(diǎn)。HOX基因分為HOXⅠ類和HOX Ⅱ類基因，其中人的HOX基因家族屬于HOXⅠ類基因，有HOXA/B/C/D四個(gè)簇，近些年的研究發(fā)現(xiàn)HOX基因影響多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[8,9]。HOXD10是HOX基因家族中的一個(gè)成員，在腫瘤中的研究相對較少。有研究表明，腫瘤中HOXD10表達(dá)缺失或降低，可能發(fā)揮抑癌作用[10,11]。如胃癌中HOXD10表達(dá)降低，過表達(dá)HOXD10可抑制細(xì)胞的增殖和侵襲、克隆形成、阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]；miR-224通過靶向HOXD10調(diào)控下游相關(guān)分子而影響肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力[13]。結(jié)直腸癌中HOXD10的研究相對較少，有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中HOXD10的低表達(dá)與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系，miR-10b可通過靶向HOXD10促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲[6,7]，過表達(dá)HOXD10對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究的尚未清楚。

本研究中首先檢測不同結(jié)直腸癌細(xì)胞中HOXD10的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在HT29細(xì)胞中HOXD10的表達(dá)最低，因此選擇作為研究對象。通過將過表達(dá)HOXD10的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HOXD10的表達(dá)明顯升高，說明過表達(dá)HOXD10的HT29細(xì)胞建立成功，且發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOXD10可明顯抑制HT29細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這提示過表達(dá)HOXD10可影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。Notch信號通路是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，不僅影響細(xì)胞正常發(fā)育、增殖分化和凋亡，且影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，由Notch受體、配體及核內(nèi)結(jié)合蛋白和靶基因組成，在多種腫瘤中Notch信號通路處于激活狀態(tài)，如結(jié)直腸癌、乳腺癌等，而抑制Notch信號通路可降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-15]。TGF-β是一組多能效生長抑制因子，具有非常廣泛的生物學(xué)活性，參與組織發(fā)育、免疫反應(yīng)等過程，發(fā)揮免疫抑制作用，可介導(dǎo)結(jié)直腸癌的免疫逃逸[16,17]。有研究顯示，抑制Notch信號通路可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌的EMT轉(zhuǎn)變[18]，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)是調(diào)控腫瘤血管生成的一個(gè)重要因素，多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制其表達(dá)可降低乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的增殖和誘導(dǎo)凋亡[19,20]。在研究腎母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞加入Notch信號通路抑制劑可抑制Notch信號通路及明顯降低VEGF的表達(dá)[21]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)HOXD10可明顯降低TGF-β1、VEGF和Notch信號通路受體Notch1、配體Jagged1及下游靶基因Hes1的蛋白表達(dá)，這提示過表達(dá)HOXD10可能通過下調(diào)Notch信號通路影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞HOXD10基因表達(dá)可抑制癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達(dá)，機(jī)制可能與下調(diào)Notch信號通路有關(guān)。本研究可能為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供了一定的理論基礎(chǔ)，但本研究檢測的內(nèi)容有限，值得進(jìn)一步深入在體內(nèi)及體外進(jìn)一步研究。