湯夏蓮 陳 平 唐義平 張 敏 曹曉紅

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院老年內分泌科,成都 610072)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是常見的一種糖尿病微血管并發(fā)癥，高血糖引起的腎小球系膜細胞的凋亡在DN發(fā)病過程中有重要作用，也是DN腎損傷的主要機制[1]。miRNA(microRNA)是一類單鏈的小分子RNA，約由19～25個核苷酸組成，不編碼蛋白，在個體發(fā)育、細胞增殖、凋亡、分化及腫瘤形成等過程中發(fā)揮重要作用[2]。目前已發(fā)現多個miRNA影響DN的發(fā)生及發(fā)展，且腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞等的功能及結構也受到miRNA的調節(jié)[3,4]。miR-148b是miRNA大家族中的一員，目前關于miR-148b在DN中的研究較少，有研究發(fā)現，mTORC1的異常激活可通過抑制miR-148b-3p引起腎小球上皮細胞損傷或凋亡[5]；miR-148b的異常表達可促進IgA腎病IgA1的異常糖基化[6]，這提示miR-148b可能在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究旨在觀察抑制miR-148b表達對高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1表達的影響，并進一步研究對其影響的可能分子機制，以期為DN的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 低糖、高糖培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco；miR-148b scramble和miR-148b inhibitor由廣州瑞博生物科技有限公司設計并合成；CCK8試劑購自日本同仁研究所；RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒均購自日本TaKaRa；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；TGF-β1、p-IκBα、cyclinD1、Bax抗體購自美國Abcam；Lowry蛋白定量試劑盒購自上海生工；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI；酶標儀購自美國Bio-Rad；流式細胞儀購自美國BD。

1.2方法

1.2.1細胞及培養(yǎng) 小鼠腎小球系膜細胞(MMCs)購自美國菌種保藏中心(Manassas，VA)。復蘇凍存在液氮罐中的MMCs細胞，復蘇后的細胞在DMEM-F12培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清及青鏈霉素雙抗)中，置于5%體積分數的CO2培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)，每天換液1次，細胞達80%左右生長融合時消化傳代。實驗為生長至對數期的細胞。

1.2.2實驗分組及轉染 分組：①低糖+miR-148b scramble組(LG組，5.6 mmol/L的葡萄糖處理細胞后瞬時轉染miR-148b scramble)；②高糖+miR-148b scramble組(HG組，30 mmol/L的葡萄糖處理細胞后瞬時轉染miR-148b scramble)；③高糖+miR-148b inhibitor組(HG+miR-148b inhibitor組，30 mmol/L的葡萄糖處理細胞后瞬時轉染miR-148b inhibitor)。其中miR-148b scramble和miR-148b inhibitor的轉染參照脂質體LipofectamineTM2000轉染說明進行瞬時轉染。轉染前1 d以每孔3.6×105個細胞接種細胞于6孔板，細胞達80%～90%生長融合率時進行轉染。收集轉染后48 h的三組細胞用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3各組細胞miR-148b的表達檢測 采用qRT-PCR法。利用Trizol法提取轉染后48 h的三組細胞的總RNA，用Oligo6.0軟件設計目的基因miR-148b及內參基因U6引物。參照試劑盒說明設置反應體系及參數，進行實時熒光定量PCR檢測。

1.2.4細胞活力檢測 采用CCK8法。以每孔5 000個細胞接種轉染后的三組細胞于96孔板，每組設置5個重復孔，收集按照上述分組處理后的細胞，在每個細胞孔中加入CCK8試劑10 μl，酶標儀檢測各孔的吸光度值(OD值)，波長為570 nm。實驗重復3次。

1.2.5細胞凋亡率檢測 以每孔1×106個細胞接種三組細胞于96孔板，培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌細胞，Binding緩沖液500 μl懸浮細胞，分別加入FITC標記的Annexin V及PI各5 μl，輕柔混勻，室溫避光染色10～15 min，上機，流式細胞儀檢測三組細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.6TGF-β1、p-IκBα、cyclinD1、Bax蛋白表達檢測 在轉染48 h的三組細胞中加入適量的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，Lowry法測定蛋白濃度，每孔道上樣等量蛋白(40 μg)行SDS-PAGE，電泳后切掉多余的凝膠，電轉移目的凝膠至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉膜1 h，4℃搖床孵育1∶1 000稀釋的TGF-β1、p-IκBα、cyclinD1、Bax抗體過液，洗膜，加入辣根過氧化物標記的二抗，37℃孵育1 h，洗膜，ECL試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。以GAPDH作為內參基因，計算TGF-β1、p-IκBα、cyclinD1、Bax蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1各組細胞中miR-148b的表達 各組細胞中miR-148b的mRNA表達結果如表1所示，HG組miR-148b的mRNA表達顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組miR-148b的mRNA表達顯著低于HG組(P<0.05)。

2.2抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs活力的影響 通過CCK8法檢測各組細胞活力，結果如表2所示，HG組細胞活力顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組細胞活力顯著低于HG組(P<0.05)。

2.3抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs凋亡的影響 通過FITC標記的Annexin V 及PI雙染法，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，結果如圖1和表3所示，HG組細胞凋亡率顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組細胞凋亡率顯著低于HG組(P<0.05)。

2.4抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs免疫抑制因子TGF-β1表達的影響 通過Western blot檢測各組細胞中免疫抑制因子TGF-β1的蛋白表達，結果如圖2和表4所示，HG組細胞TGF-β1的蛋白表達顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組TGF-β1的蛋白表達顯著低于HG組(P<0.05)。

表1各組細胞中miR-148b的表達

Tab.1ExpressionofmiR-148bincellsofeachgroup

GroupsmRNA expression of miR-148bLG group1HG group7.183±0.6651)HG+miR-148b inhibitor group2.526±0.2782)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

表2抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs活力的影響

Tab.2EffectofinhibitingmiR-148bexpressiononMMCsactivityinducedbyhighglucose

GroupsODLG group0.772±0.072HG group1.269±0.1121)HG+miR-148b inhibitor group0.987±0.1032)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

圖1 抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs凋亡的影響Fig.1 Effect of inhibiting miR-148b expression on MMCs apoptosis induced by high glucose

2.5抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs中NF-κB信號通路的影響 通過Western blot檢測各組細胞中NF-κB信號通路p-IκBα及下游相關基因cyclinD1和Bax的蛋白表達，結果如圖3和表5所示，HG組細胞p-IκBα、cyclinD1和Bax的蛋白表達均顯著高于LG組(P<0.05)，而HG+miR-148b inhibitor組p-IκBα、cyclinD1和Bax的蛋白表達均顯著低于HG組(P<0.05)。

表3抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs凋亡的影響

Tab.3EffectofinhibitingmiR-148bexpressiononMMCsapoptosisinducedbyhighglucose

GroupsApoptosis rate(%)LG group2.06±0.27HG group13.47±1.211)HG+miR-148b inhibitor group5.18±0.572)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

圖2 抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs免疫抑制因子TGF-β1表達的影響Fig.2 Effect of inhibiting miR-148b expression on expression of TGF-β1 in MMCs induced by high glucose

表4抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs免疫抑制因子TGF-β1表達的影響

Tab.4EffectofinhibitingmiR-148bexpressiononMMCsonexpressionofTGF-β1inMMCs

GroupsRelative expression of TGF-β1 proteinLG group0.051±0.008HG group0.487±0.0561)HG+miR-148b inhibitor group0.122±0.0152)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

圖3 抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs中NF-κB信號通路的影響Fig.3 Effect of inhibiting miR-148b expression on NF-κB signaling pathway in MMCs induced by high glucose

表5抑制miR-148b表達對高糖誘導的MMCs中NF-κB信號通路的影響

Tab.5EffectofinhibitingmiR-148bexpressiononNF-κBsignalingpathwayinMMCsinduced

Groupsp-IκBαcyclinD1BaxLG group0.046±0.0070.116±0.0130.131±0.016HG group0.227±0.0261)0.421±0.0151)0.734±0.0781)HG+miR-148binhibitor group0.144±0.0162)0.234±0.0272)0.292±0.0352)

Note：Compared with LG group,1)P<0.05;compared with HG group,2)P<0.05.

3 討論

DN是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，病變涉及到包含腎小球內皮細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞等在內的多種細胞，最終可發(fā)展為腎小管間質纖維化及腎小球的硬化[7,8]。以往研究表明，高糖引起的系膜細胞缺失和凋亡是導致糖尿病發(fā)生腎損傷的一個主要機制[9,10]，因此，探討高糖對腎小球系膜細胞增殖、凋亡等生物學特性的影響對于DN早期防治和機制研究具有重要意義。miRNA在動植物體內有廣泛存在，可通過降解或抑制靶基因的mRNA表達而影響生物體的病理及生理過程，多項研究發(fā)現，miRNA可作為診斷DN發(fā)生及發(fā)展的一個生物標記物[11]，但仍需發(fā)現更多有效的用于DN診療的分子靶點。miR-148包含miR-148a和miR-148b，不僅可影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]，在腎病和糖尿病中也發(fā)揮重要作用，有研究發(fā)現，mTORC1的異常激活可通過抑制miR-148b-3p引起腎小球上皮細胞損傷或凋亡[5]；miR-148b的異常表達可促進IgA腎病IgA1的異常糖基化[6]。關于miR-148對腎小球系膜細胞增殖凋亡的影響及機制研究尚未清楚。

本研究旨在觀察抑制miR-148b表達對高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1表達的影響，結果顯示，高糖可誘導腎小球系膜細胞增殖和凋亡，上調TGF-β1表達，而抑制miR-148b表達后可逆轉這一效應。NF-κB是一個核轉錄因子，調節(jié)炎癥、免疫等過程，多個影響腎臟疾病進展的因子均有NF-κB的結合位點，可增加腎小球毛細血管的損傷[13,14]。有研究發(fā)現，DN患者呈現出更大的與NF-κB結合活性，其結合活性的程度與DN的嚴重程度有密切關系[15]。而抑制NF-κB信號通路可降低DN中TGF-β1、cyclinD1和Bax的表達[16,17]。TGF-β1是一個免疫抑制因子，可誘導腎小球系膜細胞增殖[18]。cyclinD1是一個細胞周期蛋白，Bax是Bcl-2家族成員之一，發(fā)揮促凋亡作用，DN可通過調節(jié)cyclinD1和Bax的表達影響腎小球系膜細胞的增殖和凋亡[19,20]。本研究結果顯示，高糖可上調NF-κB信號通路p-IκBα及下游相關基因cyclinD1和Bax的蛋白表達，抑制miR-148b表達后可降低p-IκBα、cyclinD1和Bax的表達。這提示抑制miR-148b表達可通過下調NF-κB信號通路影響DN的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，抑制腎小球系膜細胞miR-148b基因表達可抑制高糖誘導的細胞活力、凋亡率及免疫抑制因子TGF-β1表達的增加，機制可能與下調NF-κB信號通路有關。該研究提示miR-148b可能是DN診療的一個新靶點，但還需更多研究及臨床實踐支持。