卿 蕊 向晴可 劉眾齊 肖 非 陽(yáng) 帆

(邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，邵陽(yáng) 422600)

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭陰性致病菌，其主要分布于胃黏膜組織中。67%～80%的胃潰瘍和95%的十二指腸潰瘍都是由幽門(mén)螺桿菌感染引起的[1]。此外Hp還與慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤及胃癌等多種消化道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一般認(rèn)為幽門(mén)螺桿菌主要是經(jīng)過(guò)口到達(dá)胃黏膜后引起感染，居住環(huán)境、生活衛(wèi)生以及飲食習(xí)慣等因素均可對(duì)Hp的感染產(chǎn)生影響?？紤]到Hp感染率較高、致病性較強(qiáng)，預(yù)防治療Hp感染越來(lái)越受到人們的關(guān)注[2]。目前，臨床上治療Hp感染主要以抗生素療法為主，抗生素雖然能夠有效治療Hp感染，但卻并不能夠預(yù)防其反復(fù)發(fā)作。此外，抗生素的過(guò)度使用還會(huì)引起患者的不良反應(yīng)以及耐藥性菌株的產(chǎn)生。因此，通過(guò)疫苗接種來(lái)預(yù)防Hp感染具有重要的臨床意義[3]。

Hp外膜蛋白Omp18是普遍存在于Hp臨床分離株中的一種重要膜蛋白。目前已經(jīng)有研究表明，純化的Hp Omp18具有較好的免疫原性，在免疫接種BALB/c小鼠后能夠有效降低Hp的感染，提高其生存率[4]，同時(shí)PCR結(jié)果顯示Hp Omp18是一段高度保守的序列[5]。但是考慮到蛋白作為亞單位疫苗仍存在許多毒副作用，篩選有效的抗原表位有利于進(jìn)一步完善Hp疫苗的免疫抗原。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)Hp Omp18的免疫優(yōu)勢(shì)片段，并通過(guò)免疫小鼠對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，希望能為Hp臨床疫苗的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 幽門(mén)螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株由本院實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)；Hp Omp18氨基酸序列查詢GenBank獲得(AAD07846.1)；通過(guò)DNAstar軟件分析Hp Omp18的二級(jí)結(jié)構(gòu)(包括α螺旋、β折疊等結(jié)構(gòu))、親水性、表面可及性、柔韌性、抗原性預(yù)測(cè)其優(yōu)勢(shì)片段，并通過(guò)在線分析軟件(http://www.chinapeptides.com/tool.aspx)分析各片段平均水溶性后由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；6～8周雌性BALB/c小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)有限公司；羊抗鼠IgG、IgA、sIgA二抗購(gòu)自上海生物工程有限公司；小鼠細(xì)胞因子試劑盒購(gòu)自默沙克生物有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司；快速尿素酶實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自山東博邁達(dá)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠免疫與樣本收集 75只未感染的6～8周雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組每組15只，分別為PBS組、Omp18-1～Omp18-4免疫組。采取灌胃的方式進(jìn)行口服免疫：灌胃前禁食24 h，禁水 4 h，用灌胃針先給每只小鼠灌100 μl無(wú)菌的3% NaHCO3，30 min后給PBS對(duì)照組每只小鼠灌 200 μl PBS，實(shí)驗(yàn)組分別給每只小鼠灌入Omp18片段200 μl。4 h后恢復(fù)喂食，觀察小鼠情況?？诜庖呙恐?次共免疫4次。末次免疫10 d后每組處死3只小鼠用于收集血清以及腸道灌洗液，并取小鼠脾細(xì)胞制成懸液。

1.2.2血清IgG、IgA以及腸道sIgA檢測(cè) 將小鼠血清按1∶200倍稀釋,腸道灌洗液按1∶50倍稀釋后，加入至Omp18蛋白(10 μg/ml)包被好的ELISA 板中，100 μl/孔，37℃孵育1 h。洗滌液洗5次,分別加入相應(yīng)的羊抗鼠二抗( IgG 1∶10 000、IgA 1∶2 000、sIgA 1∶1 000),100 μl/孔，37℃反應(yīng)1 h。洗滌液洗5次,加入顯色液，室溫避光孵育15 min,最后加入終止液終止反應(yīng),酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔OD值。

1.2.3細(xì)胞因子檢測(cè) 將上述脾細(xì)胞懸液密度調(diào)整至5×106ml-1，并轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加900 μl脾細(xì)胞懸液。隨后用20 μg Omp18蛋白進(jìn)行刺激，轉(zhuǎn)移至5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。收集各孔脾細(xì)胞上清，按照細(xì)胞因子試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)上清中INF-γ、IL-2、IL-4、IL-6細(xì)胞因子水平。

1.2.4淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取上述收集的脾細(xì)胞懸液將細(xì)胞濃度稀釋至5×106ml-1后，加入至96孔板中，100 μl/孔。每孔加入純化的Omp18蛋白10 μg，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)以未加入蛋白的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。隨后于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)36～48 h，加入15 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后于450 nm處測(cè)定各孔OD值。刺激指數(shù)(SI)=(OD刺激組-OD空白組)/(OD未刺激組-OD空白組)。

1.2.5Hp攻擊以及感染檢測(cè) 上述各組經(jīng)過(guò)4次免疫的小鼠(每組12只)在末次免疫10 d后進(jìn)行Hp攻擊，攻擊前禁食24 h，禁水4 h，并用3%的NaHCO3灌胃中和胃酸。隨后用Hp標(biāo)準(zhǔn)株(3×107CFU)灌胃攻擊，并在3 d內(nèi)連續(xù)攻擊2次。攻擊完成后4周處死小鼠，快速取出胃組織用生理鹽水清洗2遍，隨后馬上進(jìn)行快速尿素酶實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)玫瑰紅色則視為發(fā)生感染，出現(xiàn)黃色則視為未感染。感染率=(每組小鼠感染數(shù)/每組小鼠總數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1Hp外膜蛋白Omp18生物信息學(xué)分析 GenBank中查詢獲得Hp外膜蛋白Omp18氨基酸序列，通過(guò)DNAStar軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性等信息(圖1)。通過(guò)DNAStar軟件分析結(jié)果選取Hp Omp18二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有轉(zhuǎn)角和卷曲結(jié)構(gòu)以及親水性、表面可及性、柔韌性、抗原性較強(qiáng)的片段(紅色標(biāo)記片段)，并獲得相關(guān)片段信息(表1)。最后計(jì)算片段的平均水溶性(表1)。

2.2免疫小鼠血清IgG、IgA以及腸道灌洗液sIgA分泌水平 各優(yōu)勢(shì)片段末次免疫后10 d，取小鼠血清以及腸道灌洗液ELISA分別檢測(cè)IgG、IgA以及sIgA水平。結(jié)果顯示，Omp18-1～ Omp18-4片段免疫小鼠血清中IgG、IgA水平均顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.05)；Omp18-1～ Omp18-4片段免疫小鼠腸道灌洗液sIgA同樣顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖1 Hp外膜蛋白Omp18生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis bioinformatics analysis of Hp Omp18

表1外膜蛋白Omp18免疫優(yōu)勢(shì)表位

Tab.1ImmunodominantepitopesofHpOmp18

EpitopespositionAmino acidsequenceNumberWater-solubilityOmp18-1(46-56)RGKTHPPCFTK110.4Omp18-2(68-77)DKSSHYYGTS100.1Omp18-3(147-157)RESSQIPKSYR110.8Omp18-4(230-239)RYRFSRYKNW100.2

圖2 免疫小鼠血清IgG、IgA以及腸道灌洗液sIgA水平Fig.2 Serum IgG,IgA and intestinal lavage sIgA of immunized miceNote: Compared with the PBS group,*.P<0.05.

2.3免疫小鼠脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子檢測(cè) 末次免疫10 d后，ELISA檢測(cè)經(jīng)Omp18蛋白刺激培養(yǎng)后獲得的脾細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平。如圖3所示，Omp18-1～Omp18-4片段免疫小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ、IL-2水平均顯著高于PBS組(P<0.05)；而IL-4、IL-6水平較PBS組則無(wú)顯著差異(P>0.05)。提示Omp18-1～Omp18-4片段誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫以Th1型為主。

圖3 免疫小鼠脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子檢測(cè)Fig.3 Levels of cytokines in spleen cell supernatant of immunized miceNote: Compared with the PBS group,*.P<0.05.

圖4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)Fig.4 Lymphocyte proliferation experiment of immuni-zed miceNote: Compared with the PBS group,*.P<0.05.

表2各免疫組小鼠Hp攻擊后感染率

Tab.2InfectionrateofimmunizedmiceafterHpattack

GroupsAnimalnumbersInfectiousnumbersInfectionrate(%)PBS10990.0 Omp18-112650.01)Omp18-211545.51)Omp18-311436.41)Omp18-410440.01)

Note：Compared with the PBS group,1)P<0.05.

2.4免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖情況 末次免疫10 d后取小鼠脾細(xì)胞， 經(jīng)Omp18蛋白刺激后MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，Omp18-1～ Omp18-4片段免疫小鼠淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)明顯增殖(P<0.05)。

2.5優(yōu)勢(shì)片段的抗感染保護(hù)作用 末次免疫10 d后用Hp標(biāo)準(zhǔn)株攻擊小鼠，攻擊后4周處死小鼠快速尿素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠感染情況。結(jié)果如表2，各組片段免疫后均能顯著降低小鼠Hp的感染率，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

考慮到Hp感染與胃炎、消化道潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，預(yù)防和控制Hp感染也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。盡管我們?nèi)圆磺宄﨟p具體的致病機(jī)制，但是據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有50%以上的人口感染Hp[6]。目前常用的抗生素“三聯(lián)”、“四聯(lián)”療法雖然能夠有效治療Hp感染，但是藥物不良反應(yīng)、治療后易復(fù)發(fā)等問(wèn)題均未得到較好的解決。因此免疫接種仍是預(yù)防Hp感染的最有效途徑[7]。Hp外膜蛋白Omp18是已經(jīng)被證實(shí)的具有較好免疫性的候選抗原[8]，但是由于蛋白亞單位疫苗的研究仍存在許多局限，本研究通過(guò)預(yù)測(cè)鑒定優(yōu)勢(shì)免疫片段，望能為臨床抗Hp感染疫苗的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

目前有關(guān)疫苗的研究通常以減毒或者滅活的病原體和抗原為主，即亞單位疫苗。但其仍存在許多較大的缺陷，如生物危害性較高、易發(fā)生基因變異進(jìn)而致使疫苗活力喪失等。近年來(lái)，隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)以及基因技術(shù)的不斷提高，表位疫苗的出現(xiàn)有效地解決了亞單位疫苗存在的缺陷，進(jìn)一步推動(dòng)了抗感染疫苗的研制。Deliyannis等[9]在研究T細(xì)胞表位肽結(jié)構(gòu)疫苗時(shí)，發(fā)現(xiàn)脂肽疫苗能夠有效誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞并對(duì)流感病毒感染產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。Nezafat等[10]也發(fā)現(xiàn)含HTL以及CTL表位的優(yōu)勢(shì)片段能夠在HPV動(dòng)物模型中發(fā)揮免疫保護(hù)作用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，成功預(yù)測(cè)了Hp外膜蛋白Omp18的優(yōu)勢(shì)免疫片段，具有較大的實(shí)驗(yàn)意義。

血清抗體能夠有效反映機(jī)體的體液免疫應(yīng)答水平[11]。IgG抗體在免疫應(yīng)答中起著激活補(bǔ)體，中和多種毒素的作用，其主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，具有重要免疫效應(yīng)，是機(jī)體抗感染的主要抗體。IgA分血清型和分泌型兩種，其有IgG和IgM的某些功能，能在血清中發(fā)揮一定的免疫功能，主要是在病原體入侵之初抵抗細(xì)菌感染[12]。本研究在用Omp18免疫優(yōu)勢(shì)片段免疫小鼠后，在其血清及腸道灌洗液中能夠檢測(cè)到顯著水平的IgG、IgA以及sIgA，表明預(yù)測(cè)片段能夠刺激產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，其作用效果類(lèi)似于最近的一種新型融合蛋白(融合了Hp Omp22以及HpaA)[13]。

大量研究顯示Hp抗原誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)以輔助T細(xì)胞為主，包括Th1以及Th2兩種[14]，其均能夠有效增強(qiáng)機(jī)體炎癥反應(yīng)并減少Hp在胃黏膜的感染。Th1型細(xì)胞反應(yīng)主要產(chǎn)生IL-2和IFN-γ，進(jìn)而在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗感染作用。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，主要功能為刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生免疫球蛋白，間接發(fā)揮免疫保護(hù)作用。Hp Omp26作為另一個(gè)已知的免疫優(yōu)勢(shì)抗原，其通過(guò)口服免疫能夠產(chǎn)生較高水平的IL-2和IFN-γ[15]。而本研究在檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞上清細(xì)胞因子時(shí)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)免疫組同樣能夠產(chǎn)生有顯著差異的IL-2和IFN-γ。表明本研究篩選的免疫優(yōu)勢(shì)片段與Hp Omp26相似，同樣以刺激產(chǎn)生Th1型細(xì)胞免疫為主。

淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中一個(gè)非常重要的階段[16]。因此，淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驕?zhǔn)確反映免疫優(yōu)勢(shì)片段的免疫功能以及免疫效果。本研究中，我們?nèi)∧┐蚊庖?0 d的小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)Omp18蛋白刺激后MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示Omp18-1～ Omp18-4片段免疫小鼠淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)明顯增殖，提示各片段均有較好的免疫功能?？焖倌蛩孛笇?shí)驗(yàn)是目前已知檢測(cè)Hp的有效方法，本實(shí)驗(yàn)將免疫小鼠經(jīng)Hp攻擊后快速尿素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠Hp感染情況，以評(píng)估免疫優(yōu)勢(shì)片段的保護(hù)效果，結(jié)果顯示各組片段免疫后均能顯著降低小鼠Hp的感染率，具有較好的保護(hù)作用。研究表明Hp外膜蛋白HpaA能夠通過(guò)特異性CD4+T細(xì)胞發(fā)揮抗感染保護(hù)作用[17]，而本研究中的免疫優(yōu)勢(shì)片段是否也是通過(guò)CD4+T細(xì)胞發(fā)揮作用仍然未知，需進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)篩選的Hp外膜蛋白Omp18免疫優(yōu)勢(shì)片段，均具有較好的免疫性，能夠刺激產(chǎn)生相應(yīng)的體液反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)于Hp的感染有一定的保護(hù)作用。總之，上述結(jié)果為進(jìn)一步完善抗Hp感染疫苗的研制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。