賈 萌 薛煥洲 申 權(quán) 余 淼 賈江坤 王佳佳 徐 建

(河南省人民醫(yī)院肝膽外科,鄭州 450000)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，位列致死性腫瘤的第四位，嚴重危害人們的身體健康。自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK)在機體肝臟中含量豐富，約占肝臟總淋巴細胞的30%～50%，其作為機體重要的天然免疫細胞，在抗腫瘤中起關(guān)鍵作用[1]。主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰ類鏈相關(guān)基因B(Major histocompatibility complex class Ⅰ chain-related gene B，MICB)是NK細胞表面主要活化性受體(Natural killer group 2 member D，NKG2D)的重要配體，主要表達于腫瘤(包括骨髓瘤、胃癌、肝癌、肺癌等)細胞和一些病毒感染的細胞表面。腫瘤細胞表面MICB與NK細胞表面NKG2D結(jié)合后，可激活NK細胞的殺傷功能，從而發(fā)揮免疫監(jiān)視作用[2]。已有研究顯示，MICB表達的下調(diào)能夠加速腫瘤免疫逃逸[3]。組蛋白脫乙酰酶(Histone deacetylase，HDAC)抑制劑(丙戊酸鈉)能夠誘導(dǎo)MICB表達，從而引起NKG2D介導(dǎo)的NK細胞活化，使NK細胞對肝癌細胞的毒性作用增強[4]。因此，了解腫瘤細胞中MICB的調(diào)節(jié)機制有助于開發(fā)基于NK細胞的有效抗腫瘤療法，對肝癌的治療具有重要臨床意義。miRNA作為基因表達調(diào)控的關(guān)鍵參與者，在NK細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫逃逸調(diào)節(jié)中的作用日益受到關(guān)注。已發(fā)現(xiàn)一些miRNAs能夠靶向MICB mRNA，參與調(diào)控NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性[5，6]。miR-17-92簇位于人13q31位點，能夠編碼包括miR-17-5p在內(nèi)的多個miRNA，與包括肝癌在內(nèi)等多種人類癌癥發(fā)展機制有關(guān)，且其表達與功能因不同細胞類型而存在差異[7]。生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-17-5p是MICB的一種miRNA調(diào)節(jié)因子。然而，miR-17-5p在肝細胞癌中對NK細胞毒性的敏感性尚不清楚。本研究旨在探討肝細胞癌HepG2細胞中miR-17-5p在NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性敏感性中的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1臨床資料 回顧性分析本院2015年1月至2016年6月行手術(shù)切除的肝細胞癌患者60例的腫瘤標本及癌旁非腫瘤組織標本，其中男36例，女24例，年齡30～70歲，平均(49±13)歲，術(shù)前均未進行抗腫瘤等其他治療，且均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為HCC，所有患者血清表面抗原(HbsAg)均呈陽性。根據(jù)《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準》(2001年)[8]，Ⅰ/Ⅱ期24例、Ⅲ/Ⅳ期36例。高分化癌18例、中分化癌17例、低分化癌25例。伴轉(zhuǎn)移(包括肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝外轉(zhuǎn)移)25例，不伴轉(zhuǎn)移35例。另選擇同期于本院接受肝臟手術(shù)的肝血管瘤患者(正常肝組織標本)20例，男12例，女8例，年齡30～70歲，平均(48±11)歲。兩組受試者年齡、性別等資料均衡，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肝癌、癌旁組織和正常肝組織的獲取均經(jīng)受試者知情同意，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 對NK細胞毒性敏感的人肝細胞癌HepG2細胞購自中國科學(xué)院細胞庫，凍存在本實驗室，以進行后續(xù)的復(fù)蘇，待后續(xù)實驗使用。將細胞維持在含有10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)，100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司)中，置于37℃ 5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

依賴于NKG2D受體的自然殺傷細胞NK-92MI細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫，置于含200 U/ml重組人白細胞介素-2(IL-2)、0.1 mmol/L巰基乙醇、12.5%馬血清和10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2瞬時轉(zhuǎn)染和處理 構(gòu)建含野生型MICB基因3′UTR序列和突變型MICB基因3′UTR序列的pCHECK2-MICB-3′UTR-Wt和pCHECK2-MICB-3′UTR-Mut的熒光素酶報告基因表達載體。miR-17-5p相關(guān)表達質(zhì)粒包括：miR-17-5p-mimic及其陰性對照miR-17-5p-NC、anti-miR-17-5p及其陰性對照anti-miR-17-5p-NC均購自Genecopoeia公司。

實驗一：根據(jù)Lipofectamine 2000(Invitrogen)制造商說明書，將miR-17-5p mimic、anti-miR-17-5p 及其相應(yīng)陰性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HepG2細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞進行Western blot或qRT-PCR分析確定轉(zhuǎn)染效率。

實驗二：根據(jù)Lipofectamine 2000制造商說明書，將miR-17-5p mimic、anti-miR-17-5p及其相應(yīng)陰性對照質(zhì)粒及MICB-3′UTR-Wt、MICB-3′UTR-Mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HepG2細胞中。

實驗三：根據(jù)制造商說明書將miR-17-5p mimic、miR-17-5p-NC轉(zhuǎn)染至HepG2細胞中培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)體系中加入1 mmol/L丙戊酸鈉(Sigma-Aldrich)孵育24 h，再進行后續(xù)實驗。

1.2.3熒光素酶報告基因測定 分別用miR-17-5p mimic、anti-miR-17-5p及其相應(yīng)陰性對照質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染MICB-wt或MICB-mut熒光素酶報告基因表達載體的HepG2細胞進行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，使用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)(Promega)進行分析。使用GloMax熒光讀數(shù)器(Promega)檢測熒光素酶活性。共轉(zhuǎn)染海腎螢光素酶組成型表達的pCHECK-2載體作為內(nèi)部對照。

1.2.4NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性測定 采用CytoTox 96非放射性細胞毒性檢測試劑盒(Promega)評估NK-92MI介導(dǎo)的細胞毒性。以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的HepG2細胞作為靶細胞，將NK-92MI細胞作為效應(yīng)細胞，分別按效靶比8∶1、4∶1、2∶1將效應(yīng)細胞和靶細胞加入96孔板中，靶細胞每孔10×104個細胞，將NK-92MI細胞接種至HepG2細胞中，于37℃下共孵育4 h后，收集上清液，于490 nm處檢測乳酸脫氫酶(LDH)活性。LDH是細胞裂解時釋放的穩(wěn)定胞質(zhì)溶酶。

1.2.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen)從細胞和組織中提取總RNA。使用Reverse Transcription Kit(TaKaRa)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green(TaKaRa)進行實時PCR分析。以β-Actin或U6作為內(nèi)參。利用ABI7500系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行qRT-PCR反應(yīng)。分別以β-actin和U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算miR-17-5p和MICB相對表達水平。qRT-PCR反應(yīng)條件:95℃ 45 s，56℃ 30 s，72℃ 3 min，共40個循環(huán)。引物設(shè)計如下：MICB：forward 5′-ACCTGGCTATGAACGTC-ACA-3′，reverse 5′-CCCTCTGA-GACCTCGCTGCA-3′；miR-17-5p：5′-ACTACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3′；β-actin：forward 5′-CCACGAAACTACCTTCAACTC-3′，reverse 5′-TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC-3′；U6：5′-CAAATTCGTGA-AGCGTTCCATAT-3′。

1.2.6蛋白免疫印跡(WB) 使用補充有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)和苯甲基磺酰氟尿苷(Roche)的哺乳動物蛋白質(zhì)提取試劑RIPA(Beyotime)裂解細胞。通過10%SDS-PAGE分離50 μg 蛋白質(zhì)提取物，轉(zhuǎn)移至0.22 mm硝酸纖維素膜(Sigma)中，并與特異性抗體一起孵育。使用Quantity One軟件(Life Technologies)評估相對蛋白表達水平。MICB和β-actin抗體購自Abcam。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后各組細胞中miR-17-5p和MICB的表達情況 如圖1A所示，與miR-17-5p-NC組相比，miR-17-5p-mimic組miR-17-5p表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與anti-miR-17-5p-NC組相比，anti-miR-17-5p組miR-17-5p表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

如圖1B、C所示，與miR-17-5p-NC組相比，miR-17-5pmimic組HepG2細胞中，MICB mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與anti-miR-17-5p-NC組相比，anti-miR-17-5p組HepG2細胞中，MICB mRNA和蛋白表達水平均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2miR-17-5p通過MICB 3′UTR內(nèi)的結(jié)合位點下調(diào)MICB基因表達 根據(jù)TargetScan預(yù)測(圖2A)，在MICB mRNA的3′-UTR中存在miR-17-5p的靶位點。利用熒光素酶活性測定發(fā)現(xiàn)(圖2B)，與miR-17-5p-NC+MICB 3′UTR-Wt組相比，miR-17-5p-mimic+MICB 3′-UTR-Wt組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。而miR-17-5p-NC+MICB 3′UTR-Mut組與miR-17-mimic+MICB 3′-UTR-Mut組的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3miR-17-5p與MICB蛋白在HCC組織中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系 與正常組織和對應(yīng)癌旁非腫瘤組織相比，miR-17-5p在HCC組織中的表達水平顯著增加(圖3A)，而MICB蛋白表達水平顯著降低(圖3B)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

如表1所示，miR-17-5p和MICB蛋白的表達在不同年齡、性別患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。腫瘤直徑≥5 cm時，miR-17-5p表達水平顯著高于腫瘤直徑<5 cm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者相比，當(dāng)出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時HCC腫瘤組織中miR-17-5p的表達顯著增加，而MICB 蛋白表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TNM Ⅲ/Ⅳ期患者miR-17-5p表達水平顯著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期患者，而MICB蛋白表達水平顯著低于TNM Ⅰ/Ⅲ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨腫瘤分化程度的降低，miR-17-5p表達水平逐漸增加，而MICB蛋白表達水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后各組細胞中miR-17-5p和MICB的表達情況Fig.1 Expression of miR-17-5p and MICB in each group after plasmid transfectionNote: Compared with blank group，*.P<0.05；compared with miR-17-5p-NC group，#.P<0.05；compared with anti-miR-17-5p-NC group，△.P<0.05.

圖2 miR-17-5p通過MICB 3′UTR內(nèi)的結(jié)合位點下調(diào)MICB基因表達Fig.2 miR-17-5p down-regulates MICB gene expression through binding site within MICB 3′UTRNote: *.P<0.05.

圖3 miR-17-5p與MICB在HCC組織中的表達情況Fig.3 MICB expression in HCC tissuesNote: *.P<0.05.

CharacteristicnmiR-17-5pt/FPMICB proteint/FPAge<50 year231.88±0.120.9920.3250.70±0.041.8830.065≥50 year371.91±0.110.68±0.04GenderMale241.90±0.110.0001.0000.69±0.040.0001.000Female361.90±0.100.69±0.03Tumor diameter<5 cm190.95±0.0738.3710.0001.06±0.0838.1090.000≥5 cm412.34±0.150.52±0.03Distant metastasisYes351.62±0.1021.6450.0000.83±0.0721.8400.000No252.29±0.140.49±0.04Degree of differentiationHigh181.15±0.08414.3660.0001.08±0.09637.4150.000Middle171.93±0.150.62±0.03Low252.42±0.170.45±0.04TNM stagingⅠ/Ⅱ241.17±0.0532.3000.0001.00±0.0644.4500.000Ⅲ/Ⅳ362.39±0.180.48±0.03

圖4 HCC組織中miR-17-5p和MICB 蛋白表達水平的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of miR-17-5p and MICB protein expression in HCC tissues

圖5 miR-17-5p通過靶向MICB減弱NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性Fig.5 miR-17-5p attenuates NK cell-mediated cytotoxicity by targeting MICBNote: *.P<0.05.

2.4miR-17-5p與MICB 蛋白在HCC組織中表達的相關(guān)性 在HCC腫瘤組織中隨miR-17-5p表達水平的增加，MICB蛋白表達水平逐漸降低。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，二者呈明顯負相關(guān)(P<0.05)。見圖4。

圖6 miR-17的上調(diào)抑制丙戊酸鈉對NK細胞毒性的增強Fig.6 Upregulation of miR-17 inhibits the enhanced cytotoxicity of sodium valproate on NK cellsNote: *.P<0.05.

2.5miR-17-5p通過靶向MICB減弱NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性 不同效靶比時，在HepG2細胞中，與miR-17-5p-NC組相比，miR-17-5p-mimic組NK細胞毒性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與miR-17-5p-mimic+MICB 3′UTR-Mut組相比，miR-17-5p-mimic+MICB-3′UTR-Wt共轉(zhuǎn)染組中NK細胞毒性顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5A。

WB結(jié)果顯示，與miR-17-5p-NC組相比，miR-17-5p-mimic組HepG2細胞中MICB蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與miR-17-5p-mimic+MICB 3′UTR-Mut組相比，miR-17-5p-mimic+MICB-3′UTR-Wt組中MICB蛋白表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5B。

另外，與anti-miR-17-5p-NC組相比，anti-miR-17-5p組NK細胞毒性顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5C。WB結(jié)果顯示，與anti-miR-17-5p-NC組相比，anti-miR-17-5p組MICB蛋白表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5D。

2.6miR-17-5p的上調(diào)抑制丙戊酸鈉對NK細胞毒性的增強 與Ctrl組相比，丙戊酸鈉組細胞中MICB表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與丙戊酸鈉+miR-17-5p-NC組相比，丙戊酸鈉+miR-17-5p-mimic組細胞中MICB表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6A。進一步研究HDAC抑制劑對NK細胞毒性的增強作用是否與miR-17表達調(diào)控有關(guān)。在不同效靶比下，與Ctrl組相比，丙戊酸鈉組NK細胞毒性顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與丙戊酸鈉+miR-17-5p-NC組相比，丙戊酸鈉+miR-17-5p-mimic組NK細胞毒性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6B。

3 討論

微小RNA(miRNA)作為一種非編碼RNA，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和免疫逃逸等多種生物進程中具有重要作用[9]。已有研究證實，miR-17-5p在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等多種癌癥中的表達失調(diào)[10,11]。本研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在HCC腫瘤組織中，miR-17表達水平顯著升高，且高miR-17-5p水平與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)，提示miR-17高表達促進腫瘤發(fā)生進展。然而miR-17-5p在肝癌疾病進展中的機制尚不清楚。

NK細胞作為體內(nèi)重要的淋巴細胞之一，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。NK細胞的功能受其表面活化性或抑制性受體的調(diào)節(jié)?；罨曰蛞种菩允荏w通過介導(dǎo)NK細胞的不同識別模式，傳遞活化或抑制信號，在抗感染、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要免疫功能[12]。NKG2D是NK細胞最主要的活化性受體之一，能特異地與腫瘤細胞表面的相應(yīng)配體MICB結(jié)合而使NK細胞活化，從而激活NK細胞對腫瘤細胞的毒性作用，在腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。當(dāng)腫瘤細胞表面MICB發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或表達被抑制時，導(dǎo)致NK細胞無法活化，使其對腫瘤細胞的毒性作用被抑制，無法清除腫瘤細胞，從而引起腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[13]。

腫瘤細胞存在多種機制來逃避NK細胞介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷作用[14]。在肝臟惡性腫瘤的微環(huán)境中，腫瘤抗原、微環(huán)境中的細胞因子以及其他免疫細胞的相互作用均可逃避NKG2D介導(dǎo)的識別，導(dǎo)致NK細胞活化能力及腫瘤細胞清除能力被抑制，從而參與腫瘤細胞免疫逃逸發(fā)生[15,16]。近來研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與NK細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫逃逸調(diào)節(jié)過程。臨床證據(jù)證實，miRNAs通過抑制NKG2D配體MICB的表達，參與NK細胞的腫瘤免疫逃逸[17]。miRNA作為多基因多靶點調(diào)控的上游調(diào)控因子，能夠通過與目的靶基因mRNA的堿基特異性配對，引起目的靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控目標基因的表達。miRNAs在生物進程中的調(diào)控作用十分復(fù)雜，一個miRNA能夠調(diào)控多個目標基因，且同一個目標基因可同時受多個miRNA調(diào)控。生物學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在MICB mRNA的3′-UTR中存在miR-17-5p的靶位點。本研究進一步采用熒光素酶報告基因測定證實，miR-17-5p是靶向MICB的調(diào)節(jié)分子之一，能夠通過與MICB mRNA 3′UTR內(nèi)的位點結(jié)合，下調(diào)MICB基因表達，miR-17-5p過表達能夠顯著抑制HepG2細胞中內(nèi)源性MICB的表達。另外，在HCC腫瘤組織中，miR-17-5p與MICB表達呈顯著負相關(guān)，進一步證實MICB是肝細胞癌中miR-17的直接靶標之一。

已報道，包括miR-20a、miR-93、miR-106b、miR-302c、miR-520c等多種miRNAs能夠靶向調(diào)控MICB mRNA的3′-UTRs從而調(diào)節(jié)MICB的蛋白表達水平[18]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b通過靶向MICB mRNA的3′-UTR，使Hela、PC-3、DU145等多種腫瘤細胞表面MICB表達被抑制，導(dǎo)致NKG2D識別減少，從而減少NK細胞對腫瘤細胞的毒性作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞毒性測定和蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，在不同效靶比時，miR-17-5p過表達均能夠降低HepG2細胞中NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性，同時能夠抑制MICB表達，而抑制miR-17-5p表達則能夠增加NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性，同時促進MICB表達，提示miR-17-5p能夠調(diào)控HepG2細胞對NK細胞毒性的敏感性，且這一作用與其對MICB的靶向調(diào)控有關(guān)。這些結(jié)果表明，miR-17-5p過表達通過抑制細胞表面MICB表達，從而降低HepG2細胞對依賴于NKG2D配體的NK細胞所介導(dǎo)的細胞毒性敏感性，進而抑制NK細胞對肝癌細胞的免疫清除，保護HCC細胞免受NK細胞攻擊。

已證實，HDAC抑制劑如丁酸鈉和丙戊酸鈉能夠通過上調(diào)NKG2D配體MICB表達，增強腫瘤細胞對NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性敏感性[20]。為進一步探討miR-17-5p在調(diào)節(jié)HepG2細胞對NK細胞毒性敏感性中的作用，本研究檢查了miR-17-5p是否參與HDAC抑制劑丙戊酸鈉介導(dǎo)的NK細胞毒性增強過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉處理能夠顯著抑制HepG2細胞中miR-17-5p的表達，增加MICB的表達，從而增強NK細胞毒性。而miR-17過表達能夠抑制丙戊酸鈉誘導(dǎo)的MICB表達的增強，使HepG2細胞對NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性敏感性降低。這些數(shù)據(jù)表明，miR-17-5p下調(diào)是HDAC抑制劑介導(dǎo)NK細胞毒性增強的可能機制之一。提示，靶向miR-17-5p可能成為改善HCC中基于NK細胞抗腫瘤療法的新策略。

綜上所述，miR-17-5p通過靶向MICB降低HepG2細胞對NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性敏感性，導(dǎo)致NK細胞的抗腫瘤免疫活性被抑制，從而抑制NK細胞對肝癌細胞的免疫清除，保護肝癌細胞免受NK細胞攻擊，參與腫瘤細胞免疫逃逸過程。