鄭曉強 董金鳳 芮紅兵

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液風濕科，福州 350005)

急性T細胞白血病是由感染人T細胞白血病病毒所致的一類惡性T細胞腫瘤[1]。研究表明，急性T細胞白血病是急性白血病常見的類型之一，其發(fā)病率約占兒童急性白血病發(fā)病率的15%和成年人急性白血病的25%[2]。目前對于急性T細胞白血病的治療主要以放化療為主，雖然治愈率較高，但預后復發(fā)率高達30%[3]。并且T細胞白血病細胞還具有較強侵襲性，可轉移至骨髓及骨髓外的組織和器官，導致患者預后較差[4]。因此，尋找治療急性T細胞白血病的新藥物成為了目前研究的熱點之一。迷迭香酸 (Rosmarinic acid,RA)是一類水溶性的天然酚酸類化合物，主要從唇形科植物迷迭香中分離得到，并廣泛存在于紫草科、葫蘆科等植物中[5]。研究表明，RA具有廣泛的抗氧化、抗炎、抗病毒及抗癌活性[6]。Wu等[7]研究表明，RA能誘導急性白血病CEM/ADR5000細胞凋亡和壞死，但具體的作用機制還不清楚[7]。本研究以急性T細胞白血病細胞系Jurkat為研究對象，以探究RA對急性T細胞白血病的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI1640細胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司，Annexin V細胞凋亡試劑盒購自美國Thermofisher公司，CCK8試劑盒、BCA試劑盒和RIPA裂解液購自北京索萊寶生物科技公司，Beclin1、P62、LC3、PI3K和Akt一抗購自美國Millipore公司。人急性T細胞白血病細胞株購自美國ATCC公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)Jurkat細胞，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，隔天換液，每隔2 d傳代一次。將Jurkat細胞隨機分為Jurkat組、RA (5 μmol/L) 組、RA (10 μmol/L) 組RA (20 μmol/L) 組，分別用0、5、10和20 μmol/L的RA處理細胞，24 h后進行檢測。

1.2.2CCK8檢測細胞活性 將Jurkat細胞接種于96孔板中，接種密度為1×104個/ml。將細胞隨機分為Jurkat組、RA(5 μmol/L)組、RA(10 μmol/L)組RA(20 μmol/L)組，用相應濃度的RA分別處理0、1、2、3和4 d，每孔分別加入10 μl的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h檢測各組細胞活性，計算細胞增殖倍數 (細胞增殖倍數=細胞活性/0 h時細胞活性)。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 將Jurkat細胞用不同濃度的RA處理24 h后，用0.25%的胰蛋白酶收集各組細胞，并將細胞濃度調整至1×106個/ml，用70%的酒精對細胞進行固定后，分別加入 1 μg/ml 的FITC-Annexin和PI染色液室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.4克隆形成實驗檢測細胞存活 將Jurkat細胞以100個/ml的濃度接種于培養(yǎng)皿中，并分別加入含有0、5、10和20 μmol/L RA的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3周，并經常觀察細胞，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。隨后棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，加入4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，并加入適量的GIMSA染色液室溫染色細胞15 min，15 min后洗去染色液，干燥后于可見光下觀察細胞克隆數目，計算克隆形成率 (克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%)。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達 用RIPA裂解液提取各組細胞蛋白，并用BCA試劑盒檢測細胞蛋白濃度。每組分別取30 μg的蛋白質用10% SDS-PAGE分離蛋白，用半干法將蛋白質轉移到PVDF膜，用5%的脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，隨后加入適宜濃度的一抗于4℃封閉過夜。第二天用緩沖液洗去未結合一抗，加入二抗室溫封閉1 h后，滴加顯色液用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光顯影，用Image J對蛋白質條帶進行定量分析。

1.2.6免疫熒光檢測LC3表達 將Jurkat細胞用不同濃度的RA處理后，滴加4%多聚甲醛固定細胞30 min。固定完成后用0.5%的TritonX-100對細胞膜進行通透，用緩沖液洗去TritonX-100后滴加5%的封閉用正常山羊血清室溫封閉細胞2 h，隨后以1∶200的濃度加入LC3一抗，并于4℃孵育過夜，第二天棄去一抗，加入FITC標記的二抗，室溫封閉1 h后，用緩沖液洗去殘余二抗，用含有DAPI染色液的封片液進行封片，于熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。

2 結果

2.1RA對Jurkat細胞增殖的影響 RA處理細胞24 h后，與Jurkat組比較，RA (5 μmol/L) 組、RA (10 μmol/L) 組和RA (20 μmol/L) 組細胞增殖倍數明顯降低 (P<0.01，圖1)，差異具有統(tǒng)計學意義。同時，RA (5、10、20 μmol/L) 還能顯著減少每組細胞的克隆數(P<0.01，圖2)，并具有劑量依賴性。

圖1 RA對Jurkat細胞活性的影響Fig.1 Effect of RA on cell viability of JurkatNote: Cell viability was measured by CCK8 assay.n=6,**.P<0.01 vs Jurkat group.

圖2RA對Jurkat細胞增殖形成的影響

Fig.2EffectofRAoncellproliferationofJurkatcells

Note: Cell proliferation was determined by colon formation assay.n=6,**.P<0.01 vs Jurkat group.

圖3RA對Jurkat細胞凋亡的影響

Fig.3EffectofRAoncellapoptosisofJurkatcells

Note: Cell apoptosis was determined by flow cytometry.n=6,**.P<0.01 vs Jurkat group.

2.2RA對Jurkat細胞凋亡的影響 與Jurkat組比較， RA (5 μmol/L) 組、 RA (10 μmol/L) 組和RA(20 μmol/L) 組細胞凋亡率顯著升高 (P<0.01，圖3)，表明RA能誘導T細胞白血病細胞系Jurkat細胞凋亡。

2.3RA對Jurkat細胞自噬的影響 如圖4所示，與Jurkat組比較，RA(5 μmol/L) 組、RA(10 μmol/L) 組和RA(20 μmol/L)組細胞LCⅡ/LCⅠ的比值和Beclin1的表達水平明顯升高(P<0.05,P<0.01，圖4)，RA(5、10、20 μmol/L)能顯著抑制Jurkat細胞P62的表達(P<0.01，圖4)，表明RA能誘導Jurkat細胞自噬。此外，RA(5、10、20 μmol/L)還能顯著促進LC3在Jurkat細胞中的表達(P<0.05,P<0.01，圖5)，進一步表明RA能促進Jurkat細胞自噬的發(fā)生。

圖4RA對Jurkat細胞LC3、Beclin1和P62蛋白表達的影響

Fig.4EffectsofRAonexpressionsofLC3,Belcin1andP62

Note: The protein levels was determined by Western blot.GAPDH was used as loading control.n=6,**.P<0.01 vs Jurkat group.

圖5RA對Jurkat細胞LC3蛋白表達的影響

Fig.5EffectofRAonexpressionofLC3inJurkatcells

Note: The expression of LC3 was measured by immunofluorescence.n=6,*.P<0.05,**.P<0.01 vs Jurkat group.

2.4RA對PI3K/Akt信號通路的影響 Western blot實驗結果表明，RA (5、10、20 μmol/L) 能抑制p-PI3K和p-Akt的表達，顯著降低Jurkat細胞p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值及 mTOR 的表達水平(P<0.05,P<0.01，圖6)，表明RA能抑制PI3K/Akt信號通路的激活。

圖6 RA對p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt和mTOR表達的影響Fig.6 Effects of RA on expressions of p-PI3K,PI3K,p-Akt,Akt and mTORNote: The levels of p-PI3K,PI3K,p-Akt,Akt and mTOR were measured by Western blot.GAPDH was used as loading control.n=6,*.P<0.05,**.P<0.01 vs Jurkat group.

3 討論

現(xiàn)代研究表明，天然產物在抵抗癌癥的發(fā)展和治療方面有較大的優(yōu)勢，如槲皮素、甘草素及茶多酚等[8]。RA是一類提取于迷迭香、薄荷和紫蘇果等植物中的天然化合物，大量研究表明RA具有廣譜的抗癌活性，能通過抑制肝癌、胃癌及結腸癌等癌細胞增殖，從而抑制癌癥的發(fā)展[5,9,10]，也能抑制急性淋巴細胞白血病細胞凋亡，增強全反式維甲酸對白血病NB4細胞生長的抑制作用[7,11]。本文研究發(fā)現(xiàn)，RA能降低T細胞白血病Jurkat細胞增殖倍數，并具有時間和劑量依賴性。同時，RA還能抑制Jurkat克隆的形成，表明RA具有抑制急性T細胞白血病Jurkat細胞增殖的活性。此外，RA升高Jurkat細胞的凋亡率，并隨濃度升高作用逐漸增強。細胞凋亡是指細胞程序性死亡，細胞凋亡的抑制與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。實驗結果表明RA可能通過抑制Jurkat細胞增殖、誘導細胞凋亡而減緩急性T細胞白血病的發(fā)生發(fā)展。

RA的抗癌作用涉及多個細胞和分子生物過程。RA可通過激活AMPK抑制結腸癌細胞發(fā)生上皮間質轉化，從而抑制結腸癌的轉移[12]。Wu等[13]研究發(fā)現(xiàn)RA還能通過調控Nrf2相關信號通路的激活影響乳腺癌HepG-2細胞的存活。自噬也是調控癌細胞存活的重要機制之一。研究表明，自噬在各種應激條件下能通過為細胞提供營養(yǎng)支撐，因此被認為是促進細胞存活的機制之一[14]。但也有研究表明，細胞自噬是細胞另一種程序性死亡的過程，自噬的激活可導致細胞的死亡[15,16]。癌癥自噬抑制進一步表明細胞自噬是一類腫瘤抑制途徑。PI3K、mTOR及Bcl-2等致癌基因能抑制癌細胞自噬的發(fā)生，P53、PTEN及TSC1/TSC2等抑癌基因的激活能誘導癌細胞自噬[17]。本文研究結果表明，RA能促進Beclin1和LC3表達，抑制P62表達并能升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值。Beclin1、P62和LC3均是細胞自噬的標志性蛋白。Beclin1能通過促進Beclin1-hVps34復合物的形成促進癌細胞自噬和抑制癌細胞增殖[2]。LC3則與自噬小體的形成有關，被認為是自噬小體形成的特異性標志[18]。P62與溶酶體降解有關，與自噬程度呈負相關，提示RA能誘導Jurkat細胞自噬。

PI3K/Akt信號通路是調控細胞增殖、凋亡和自噬的重要信號通路。研究表明PI3K信號通路在急性T細胞白血病細胞中呈激活狀態(tài)，被認為是治療急性T細胞白血病的作用靶標之一，抑制PI3K活性能誘導T細胞白血病細胞的凋亡[19]。Akt是PI3K的下游靶標，PI3K激活可促進Akt活化，從而調控細胞生物學過程。Simioni等[20]研究表明，PI3K/Akt通路能參與T細胞白血病細胞增殖、凋亡自噬等過程的調控，用抑制劑抑制Akt活性后，T細胞白血病細胞的活性明顯降低，細胞出現(xiàn)G0/G1期周期阻滯，并且還能誘導細胞凋亡和細胞自噬。本文研究發(fā)現(xiàn)RA還能抑制p-PI3K和p-Akt的表達，顯著降低p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值，表明RA能抑制Jurkat細胞PI3K/Akt信號通路激活，提示RA抑制Jurkat細胞增殖，誘導細胞凋亡和自噬的作用可能與抑制PI3K/Akt信號通路激活有關。

綜上所述，RA能顯著降低急性T細胞白血病Jurkat細胞增殖倍數，抑制細胞克隆形成，并能升高細胞凋亡率、促自噬標記蛋白Beclin1、LC3的表達，降低P62的蛋白表達水平，同時還能顯著降低PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值，提示RA能誘導急性T細胞白血病Jurkat細胞自噬和細胞凋亡，作用機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路激活有關。本研究初步探究了RA對T細胞白血病Jurkat細胞增殖、凋亡及自噬的作用與機制，為RA應用于急性T細胞白血病的治療提供了實驗數據支撐。