任天寶，楊艷東，高衛(wèi)鍇，李宙文，閻海濤，王省偉，劉國順

(1.河南農業(yè)大學/河南省生物炭工程技術中心，河南 鄭州 450002； 2.廣東中煙工業(yè)有限責任公司，廣東 廣州 510000; 3.河南省煙草公司鄭州市公司，河南 鄭州 450000)

生物炭(Biochar)是指作物秸稈、木質物質、禽畜糞便等含碳量豐富的生物質在無氧或限氧的條件下經過高溫(350～700 ℃)熱解而形成的富含有機碳的物質，將其施入土壤，可以增加土壤有機質或腐殖質的含量[1-5],進而影響土壤的生物活性和理化性質，如土壤pH值、陽離子交換量(CEC)、容重、孔隙度和含水量等[6-12]，這些理化性質又將會影響微生物活性和微生物群落結構。生物炭還具有改善微生物細胞的附著性能、促進特定類群土壤微生物棲息和生長的作用，并且能夠改變土壤養(yǎng)分的生物有效性等。土壤微生物被視為陸地生態(tài)系統(tǒng)中的主要分解者，在構建自身生物量獲取資源的同時，可促使生態(tài)系統(tǒng)中物質轉化和能量流通，同時調控養(yǎng)分與碳在土壤-植物-大氣之間的平衡與循環(huán)，進而對土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能和結構產生影響。已有研究表明，生物炭可以改變土壤微生物群落組成、豐度、活性及多樣性等[13-17]。顧美英等[15]研究施用生物炭對新疆石河子墾區(qū)灰漠土和風沙土土壤養(yǎng)分和微生物多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，施用生物炭后灰漠土和風沙土根際土壤細菌和真菌數(shù)量均增加,根際土壤細菌數(shù)量分別提高2.2%和72.1%，真菌數(shù)量分別提高80.0%和83.3%。陳澤斌等[16]研究生物炭不同施用量對煙草根際土壤微生物多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，在生物炭施用量為50～150 g/棵時，隨著生物炭施用量的增加，根際土壤細菌種類的多樣性和分布的均勻程度均提高。陳懿等[17]研究表明，施用生物炭可以增加植煙土壤微生物數(shù)量。

一般而言，土壤中可進行平板培養(yǎng)的微生物數(shù)量僅占0.1%～1.0%[18-19]，傳統(tǒng)培養(yǎng)所得到的微生物群落信息極小[20]。土壤微生物非培養(yǎng)研究方法，如DNA指紋圖譜技術、磷脂脂肪酸分析法以及微陣列基因芯片等方法雖然克服了培養(yǎng)技術的一些缺點[21]，但是這些方法與第2代測序方法相比，仍有通量低和信息量小的缺點[22]。第2代測序方法以Illumina公司的Solexa，Roche公司的454，Life Technologies公司的SOLiD、IonTorrent為主[23-24]。這些測序平臺具有快捷、價格相對較低、數(shù)據(jù)產出通量高等特點，在土壤微生物物種、結構、功能和遺傳多樣性的研究中可以獲得大量的信息[25]。為此，以湘西山地植煙土壤為研究對象，采用Illumina Miseq測序技術對土壤細菌群落結構進行分析，以期為生物炭改良山地土壤生物學特性提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗于2016年2—7月在湖南永順縣松柏鎮(zhèn)廣東中煙基地單元核心示范區(qū)進行，試驗田地處亞熱帶季風氣候區(qū)(108°21′～116°07′E、29°05′～33°20′N)，四季分明，雨熱同季。全年日照時間為1 100～2 150 h，年平均氣溫為15～17 ℃，無霜期為230～300 d，年降水量約為580 mm。供試土壤為黃棕壤。供試烤煙品種為K326。試驗地土壤含堿解氮59.71 mg/kg、速效氮91.51 mg/kg、速效磷23.11 mg/kg、速效鉀157.65 mg/kg，pH值為5.4。

生物炭由河南省生物炭工程技術研究中心提供，原料為花生殼，在350 ℃條件下炭化4 h制成，其含全碳71.50%、水分9.00%、總氮1.9%、總磷3.00%、總鉀0.8%,pH值為8.5。

1.2 試驗設計

試驗設置5個處理：OEE(原生態(tài)土壤，取自未耕作過的土地)、CK(生物炭用量為0)、T1(生物炭用量為0.75 t/hm2)、T2(生物炭用量為1.5 t/hm2)和T3(生物炭用量為2.25 t/hm2)，每個處理重復3次，小區(qū)面積為25 m2。煙苗于2月10日移栽，種植密度為16 500株/hm2，2月5日將生物炭在起壟之后施入壟臺之上，施肥方式為穴施，施肥點距離煙株15 cm，所有處理水肥管理與大田管理一致。

1.3 土壤樣品的采集

在烤煙采收完畢后(2016年8月5日)進行土壤樣品(根系土)的采集。按照5點取樣法分小區(qū)進行采樣。采集時先除去地面植被和枯枝落葉，鏟除1 cm左右的表土，再進行0～20 cm耕層土壤采集，混勻后采用四分法保留1 kg土壤樣品裝入已滅菌的牛皮紙袋中，立即放入4 ℃冰盒中保存。將冷藏土樣帶回實驗室后，剔除植物殘體、較大的土壤動物及石頭等，再迅速過2 mm篩。然后在-80 ℃條件下保存，用于土壤細菌16S rDNA 序列的測序分析。

1.4 土壤總DNA的提取及16S rDNA序列測定

參照Omega公司的D5625-01 Soil DNA Kit土壤基因組DNA提取試劑盒的說明書提取土壤樣品DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢查后，用無菌水稀釋至1 ng/μL。

使用帶標簽序列的ITS2 區(qū)及16S rDNA-V4 區(qū)特異引物3F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)、4R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)和515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806R( 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，使用KODPlus-Neo高保真酶進行PCR擴增，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海美吉生物信息科技有限公司進行測序。

1.5 下機數(shù)據(jù)的質控及分析

剔除標簽序列和引物序列，用FLASH 軟件[26]進行序列拼接，經Qiime軟件[27]過濾后與Gold database 數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，再用UCHIME 軟件[28]去除嵌合體序列，得到有效序列。用Uparse軟件[29]在97%的相似性水平上劃分操作分類單元(OTU)，代表序列用RDP Classifier 軟件[30]和Green Gene 數(shù)據(jù)庫[31]進行物種注釋。利用Mothur軟件作稀釋度曲線。采用R語言繪制樣品OTU的韋恩圖、PCA圖、多重比較圖和熱圖。

參考Kim等[13]的方法分析細菌Alpha多樣性，其評價指標主要包括Chao1、覆蓋度和Shannon指數(shù)等。其中，Chao1在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)；覆蓋度是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低；Shannon指數(shù)是用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)之一。

2 結果與分析

2.1 生物炭施用量對湘西山地植煙土壤細菌物種組成的影響

由圖1所示，不同處理土壤樣品中公有OUT為1 483個，占總OTU數(shù)的8.69%。施用生物炭的T1、T2、T3處理與CK土壤樣品中公有OTU分別為2 773、2 556、2 734個，表明隨著生物炭施用量的增加，生物炭處理與對照處理中細菌種類的相關性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，這可能是因為生物炭改善了土壤物理結構和微環(huán)境，為細菌生長提供了更多的生存空間和資源，從而促進了細菌的生長發(fā)育[32-33]。OEE土壤樣品中，與CK土壤樣品中公有的OUT占31.98%，表明長期施用化肥會對農田細菌物種組成造成明顯影響。

圖1 不同處理土壤細菌OTU分布

2.2 生物炭施用量對湘西山地植煙土壤細菌多樣性的影響

由表1可以看出，細菌Chao1值隨生物炭施用量增加先降低后增加，與OEE相比，生物炭處理細菌Chao1值均明顯提高，但均低于CK；覆蓋度隨生物炭施用量增加先增加后降低，生物炭處理的覆蓋度均高于CK，但均低于或者等于OEE；Shannon指數(shù)隨生物炭施用量的增加先降低后增加，生物炭處理的Shannon指數(shù)均低于CK，且僅T1處理高于OEE。推測生物炭的施入可能改變了土壤的基本理化特性，提高了土壤的通透性，進而影響了土壤中厭氧環(huán)境條件下的細菌多樣性，致使多樣性指數(shù)降低。

表1 不同處理土壤細菌Alpha多樣性

由圖2可知，主成分1(PC1)與主成分2(PC2)對土壤樣品的貢獻率分別達到62.16%和14.41%。此外，OEE、CK土壤樣品均位于PC1的負值區(qū)域，分別位于PC2坐標軸負、正兩側，說明這2組樣品間的主成分變異顯著；T1、T2和T3處理樣品均位于PC2坐標軸附近，對PC2的貢獻表現(xiàn)為T2和T3處理間差異不明顯，但均大于T1處理，這也進一步說明了生物炭對土壤樣品細菌群落有明顯影響?？傮w而言，施用生物炭影響了土壤細菌種群結構，且隨生物炭施用量的增加，該影響程度隨之增加。

圖2 不同處理土壤細菌群落結構主成分分析

2.3 生物炭施用量對湘西山地植煙土壤細菌群落結構的影響

由圖3可知，對各處理中優(yōu)勢細菌變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、螺旋體菌門(Saccharibacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)進行豐度分析表明，酸桿菌門和綠彎菌門在各處理間的群落豐度均達到了顯著水平(P<0.05)，而其他菌門群落豐度在各處理間差異均達到了極顯著水平(P<0.01)。施用生物炭處理變形菌門群落豐度顯著高于OEE(P<0.05)，而這種程度隨生物炭施用量的增加而增加，與CK相比，僅T3處理的變形菌門群落豐度提高。施用生物炭處理酸桿菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加而降低，均低于OEE和CK，OEE酸桿菌門群落豐度最高。施用生物炭處理放線菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加呈先降低后增加的趨勢，均高于CK、低于OEE。施用生物炭處理綠彎菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加而降低，均高于CK，僅T1處理高于OEE。施用生物炭處理芽單胞菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加呈先降低后增加的趨勢，均高于OEE，T1、T3處理均高于CK。施用生物炭處理螺旋體菌門群落豐度隨生物炭施用量的增加呈先增加后降低的趨勢，均高于OEE，僅T2處理高于CK。施用生物炭處理裝甲菌門群落豐度變化趨勢與螺旋體菌門相似，也隨生物炭施用量的增加呈先增加后降低的趨勢，均高于OEE和CK。綜上，與CK相比，生物炭施入植煙土壤后，對放線菌門、綠彎菌門、裝甲菌門群落豐度有明顯的促進作用，而對酸桿菌門群落豐度有一定的抑制作用。

圖3 不同處理土壤優(yōu)勢細菌門水平上相對豐度分析

由圖4可知，隨著生物炭施用量的增加，各處理細菌優(yōu)勢菌門組成相似度增加，這表明施用生物炭可以促使細菌種群朝特定方向改變，而這種改變程度與生物炭施入量有關。OEE與其余處理的細菌優(yōu)勢菌門組成相似度低，生物炭處理之間細菌優(yōu)勢菌門組成相似度較高，與OEE細菌優(yōu)勢菌門組成相似度較低，與CK細菌優(yōu)勢菌門組成相似度較OEE高,但較其余生物炭處理低，說明經耕作后的土壤細菌群落組成會發(fā)生較大改變。各處理中變形菌門與其余菌門相似度低，而芽單胞菌門與螺旋體菌門、放線菌門與綠彎菌門的群落組成相似度較高。

用顏色梯度表示物種所占比例的大小，顏色越深說明該物種所占比例越大圖4 不同處理土壤細菌優(yōu)勢菌門組成及聚類分析

3 結論與討論

本研究對土壤細菌群落結構分析發(fā)現(xiàn)，與CK相比，生物炭施入植煙土壤后，對酸桿菌門群落豐度有一定的抑制作用，這與姚欽[27]的研究結果一致，因為生物炭呈堿性，施入土壤中不利于酸桿菌門細菌的生長；對放線菌門、綠彎菌門、裝甲菌門群落豐度有明顯的促進作用，這可能是因為生物炭的多孔性，為細菌在土壤中生長及繁殖提供了更多的空間，從而增加了細菌的數(shù)量，同時還調節(jié)了土壤環(huán)境的物理和化學性質，影響土壤微生物生長、發(fā)育和代謝[28]。本研究通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，生物炭可以促使土壤細菌群落結構向特定的方向發(fā)展，在這種發(fā)展的同時，相對于CK，生物炭處理的細菌多樣性有所降低，這可能是因為土壤細菌對土壤酸堿度和有機質含量較敏感[29]，同時對土壤物理特性(土壤容重、含水率、溫度)依賴性也較強[30]。陳溫福等[31]研究表明，生物炭能夠有效增加土壤pH值，同時會增加土壤有機質含量。王歡歡等[32]研究表明，生物炭能夠改善土壤物理特性，降低土壤容重，提高土壤孔隙度。所以，當生物炭改變土壤基本理化性狀后，細菌為適應土壤的改變而改變自身的群落結構[33]，導致適應性較強或喜好這種改變的細菌菌群得以保留和發(fā)展[34]。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，相對于與OEE相比，生物炭處理與CK的細菌群落結構有著更強的相似性，這可能是因為CK也是經過人類長期改造的耕作土壤，生物炭處理也是耕作土壤，只因生物炭的近期改造不足以使土壤細菌達到原始水平，而人類改造土壤的方式具有相似性，導致生物炭處理與CK的細菌群落結構表現(xiàn)出了相似性。

土壤中不同細菌門類在土壤中發(fā)揮著不同的作用，其豐度的變化可能影響土壤的生態(tài)功能。因此，在今后的研究中可以進一步研究生物炭對功能微生物多樣性、作物抗土傳病害及碳、氮代謝途徑的影響，為農田土壤微生態(tài)的調控和作物的生長發(fā)育提供更多理論依據(jù)。