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(1.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北 石家莊 050061； 2.河北省林木良種工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050061； 3.天津創(chuàng)世生態(tài)景觀建設(shè)股份有限公司，天津 300000； 4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071000)

種質(zhì)資源又稱遺傳資源，是物種進化、遺傳學(xué)研究及植物育種的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。離體保存法作為植物種質(zhì)資源圃活體保存替代技術(shù)，是保證植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的一種新興途徑[2-3]，可以有效延長組培苗繼代周期，避免頻繁繼代，節(jié)約培養(yǎng)成本，并且使材料一直處于生長狀態(tài)，保持種質(zhì)優(yōu)良特性。相關(guān)研究[4-7]表明，甘露醇、山梨醇等高滲保透劑以及CCC、ABA、PP333等植物生長延緩劑可以有效抑制植物組培苗的高生長，使組培苗節(jié)間縮短，并矮化、壯化植株，已經(jīng)在南天竹[8]、馬鈴薯[5]、茶樹[9]等植物的研究上取得了較有價值的研究成果。

有髯鳶尾(BeardedIris)，為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris)多年生草本植物，是垂瓣上有髯毛附屬物的鳶尾品種的統(tǒng)稱[10-11]。目前，全世界有髯鳶尾已超過2萬余種[12]，花色包括了除正紅色以外所有的顏色，有髯鳶尾不同的花色組合不僅可以美化、香化環(huán)境，還能形成良好的園林綠化景觀。在現(xiàn)階段，有髯鳶尾種質(zhì)資源主要依靠活體保存[13]，而活體保存需要現(xiàn)代設(shè)施條件，保存成本較高，且易受病蟲害等的影響而造成珍貴品種資源的流失。此外，在生產(chǎn)過程中，有髯鳶尾組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗需4～6個月的時間[14-16]，且外植體花蕾的采集受花期限制，不可避免出現(xiàn)頻繁繼代培養(yǎng)，造成人力物力浪費以及可能發(fā)生變異等問題。因此，為克服傳統(tǒng)活體保存方法的缺點，解決組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中出現(xiàn)的問題，開展有髯鳶尾種質(zhì)資源離體保存研究迫在眉睫。鑒于此，選用PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇6種藥劑，對有髯鳶尾的離體保存方法進行了初步研究，以期為有髯鳶尾的種質(zhì)離體保存優(yōu)化、組培產(chǎn)業(yè)化以及種質(zhì)創(chuàng)新提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇穩(wěn)定、正常生長的有髯鳶尾1A(印度首領(lǐng)×白與藍)繼代5次組培苗為試驗材料，在河北省林業(yè)科學(xué)研究院組培實驗室進行有髯鳶尾種質(zhì)離體保存研究。

1.2 試驗方法

采用單因素試驗設(shè)計，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇，每種藥劑的質(zhì)量濃度梯度見表1。對照(CK)不添加藥劑。培養(yǎng)基中瓊脂為6.5 g/L，蔗糖為30.0 g/L，pH值為5.8～6.0，采用塑料封口膜封口，高壓滅菌。滅菌溫度為121 ℃，滅菌時間為18 min。將有髯鳶尾1A組培苗以芽間剝離的方式分成3株/叢，接種到培養(yǎng)基中，每處理接種15瓶，每瓶接種3叢。每處理重復(fù)3次。培養(yǎng)室中溫度為23～25 ℃，光照強度為1 000～1 500 lx，光照時數(shù)為12 h/d(每日的6：00—18：00為光照時間)。

表1 有髯鳶尾1A組培苗種質(zhì)離體保存不同藥劑質(zhì)量濃度設(shè)置

注：P、B、C、A、G、S分別代表PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇。

1.3 測定指標與方法

接種完成后，隨時觀察、記錄組培苗的生長狀況。接種120 d時統(tǒng)計存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高。其中，株高為株叢基部到頂部之間的距離(不包括根莖)。

存活率=存活株數(shù)/接種株數(shù)×100%；

黃葉率=黃葉株數(shù)/接種株數(shù)×100%；

增殖倍數(shù)=增殖后芽數(shù)/起始芽數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel進行表格記錄與數(shù)據(jù)運算，用DPSv 7.05進行差異顯著性檢驗。用隸屬函數(shù)法綜合評價不同處理的離體保存效果，對存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高的隸屬值進行累加，求取平均值。

X(u)= (X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X(u)為各指標隸屬函數(shù)值累加后求取的平均值。X為某一處理的某一指標的測定值，Xmax為所有處理在該指標中的最大值，Xmin為所有處理在該指標中的最小值。隸屬函數(shù)值平均值越大，組培苗生長越好，離體保存效果也越好[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PP333對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表2可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的PP333對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個指標部分處理間差異達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，P1—P5處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡?？梢?，不同質(zhì)量濃度PP333均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著PP333質(zhì)量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現(xiàn)明顯下降趨勢，而增殖倍數(shù)則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，P4即PP3338.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為3.1，株高為6.8 cm。PP333質(zhì)量濃度過高會對組培苗產(chǎn)生毒害作用。另外，P4處理有少量生根現(xiàn)象，這可能與適宜濃度的PP333能促進鳶尾組培苗的生根生長有關(guān)。

表2 不同質(zhì)量濃度PP333對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

注：不同大、小寫字母表示在0.01、0.05水平差異，下同。

2.2 B9對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表3可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的B9對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，B1—B5處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡。可見，不同質(zhì)量濃度B9均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著B9質(zhì)量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現(xiàn)出明顯下降趨勢，而增殖倍數(shù)則是先上升后下降。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，B5即B915.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，黃葉率為50.0%，增殖倍數(shù)為2.9，株高為 4.9 cm。

表3 不同質(zhì)量濃度B9對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.3 CCC對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表4可以看出，添加不同濃度的CCC對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，C1—C5處理組培苗存活率均在75.0%以上，CK組培苗全部死亡?？梢?，不同質(zhì)量濃度CCC均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨CCC質(zhì)量濃度的增加，株叢存活率逐漸升高，黃葉率依次降低，增殖倍數(shù)、株高均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，C5即CCC 40.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為3.4，株高為5.8 cm。

表4 不同質(zhì)量濃度CCC對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.4 ABA對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表5可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的ABA對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，A1—A5處理組培苗存活率均在66.8%以上，CK組培苗全部死亡?？梢姡煌|(zhì)量濃度ABA均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著ABA質(zhì)量濃度的增加，株叢存活率、增殖倍數(shù)、株高均呈現(xiàn)明顯下降趨勢，而株叢黃葉率則表現(xiàn)為先降低后上升的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，A3即ABA 4.0 mg/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為91.8%，黃葉率為13.2%，增殖倍數(shù)為2.5，株高為3.4 cm。ABA添加濃度過高，對株叢生長的抑制作用過大，反而會產(chǎn)生毒害作用，嚴重影響株叢的正常生長與增殖。

表5 不同質(zhì)量濃度ABA對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.5 甘露醇對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表6可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的甘露醇對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，G1—G4處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡?？梢姡煌|(zhì)量濃度甘露醇均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著甘露醇質(zhì)量濃度的增加，株叢黃葉率、株高均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，而增殖倍數(shù)則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，G4即甘露醇40.0 g/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為2.9，株高為2.6 cm。

表6 不同質(zhì)量濃度甘露醇對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.6 山梨醇對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

由表7可以看出，添加不同質(zhì)量濃度的山梨醇對有髯鳶尾1A組培苗的生長影響明顯，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個指標部分處理間差異分別達到顯著或極顯著水平。接種120 d時，S1—S4處理組培苗存活率均為100%，CK組培苗全部死亡?？梢?，不同質(zhì)量濃度山梨醇均對有髯鳶尾1A組培苗的生長起到較強的抑制作用。隨著山梨醇質(zhì)量濃度的增加，增殖倍數(shù)、株高均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，而株叢黃葉率則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。綜合考慮抑制效果及株叢生長狀況，S3即山梨醇30.0 g/L的處理，較有利于有髯鳶尾1A組培苗120 d的保存，其株叢存活率為100%，無黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為2.2，株高為4.4 cm。山梨醇添加濃度過高，對株叢生長的抑制作用過大，反而會產(chǎn)生毒害作用，嚴重影響株叢的生長與增殖。

表7 不同質(zhì)量濃度山梨醇對有髯鳶尾1A組培苗生長的影響

2.7 有髯鳶尾1A組培苗離體保存處理綜合評價

由表1—7可知，存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高4個指標的最優(yōu)處理并不相同，因此，對4個指標進行了隸屬函數(shù)評價。由綜合評價結(jié)果(表8)可知，G4處理的綜合評價值最高，達到81.87；其次是G3處理，綜合評價值為81.66；再次是S3處理，綜合評價值為81.44；P5、C5、P4、C4 4個處理的綜合評價值也均在80以上，組培苗生長狀況均良好。而A5處理綜合評價值最低，僅為37.06，組培苗株叢受害嚴重。綜上可知，有髯鳶尾有髯鳶尾1A組培苗的種質(zhì)離體保存最佳處理為G4，組培苗接種120 d時，株叢存活率為100%，無黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為2.9，株高為2.6 cm。

表8 有髯鳶尾1A組培苗離體保存處理綜合評價

3 結(jié)論與討論

常規(guī)組織培養(yǎng)條件下，有髯鳶尾的最佳繼代周期約為30 d。當(dāng)繼代周期>30 d時，會導(dǎo)致株叢出現(xiàn)葉片黃化、腐爛、衰老，乃至死亡，不利于下一代的增殖培養(yǎng)。相關(guān)研究表明，甘露醇與山梨醇是同分異構(gòu)體，屬于惰性物質(zhì)，不易被外植體吸收，可以提高培養(yǎng)基的滲透壓，抑制植物細胞吸水，延緩植株生長[18]；CCC是一種季銨鹽類植物生長調(diào)節(jié)劑，具有矮化植株的作用[8]；ABA具有抗赤霉素的作用，降低RNA聚合酶的活性，抑制DNA的合成，從而抑制材料的生長[19]；B9是一種高效低毒的植物生長延緩劑，可抑制莖端下部區(qū)域的細胞分裂和伸長生長[5]；PP333是植物生長延緩劑[6]，可抑制赤霉素的生物合成，使植株節(jié)間縮短，株型緊湊，矮小健壯。本研究發(fā)現(xiàn)，添加不同質(zhì)量濃度的PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇均能有效抑制有髯鳶尾1A組培苗的生長，株叢保存培養(yǎng)120 d仍生長正常，不需要轉(zhuǎn)接繼代，極大地延長了繼代周期。可見，使用PP333、B9、CCC、ABA、甘露醇、山梨醇6種藥劑進行有髯鳶尾的種質(zhì)離體保存均具有較高的可行性。

利用隸屬函數(shù)法進行試驗結(jié)果的綜合評價，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到植物抗性、生理、繁殖等[20-23]研究中，并得到大多數(shù)學(xué)者和專家的認可。綜合考慮有髯鳶尾1A組培苗培養(yǎng)120 d的抑制效果及株叢生長狀況，PP333、B9、CCC、ABA和甘露醇、山梨醇最適質(zhì)量濃度分別為8.0、15.0、40.0、4.0 mg/L和40.0、30.0 g/L。本研究條件下，ABA、山梨醇質(zhì)量濃度過高時，對株叢生長的抑制作用過大，嚴重影響株叢的生長與增殖，表明藥劑添加濃度過高，反而會產(chǎn)生毒害作用。這與在文心蘭[2]、草莓[7]、香果樹[24]、葡萄[25]等植物上的離體保存研究結(jié)果相似。

另外，PP3338.0 mg/L處理中組培苗出現(xiàn)少量生根現(xiàn)象，這可能與適宜濃度的PP333能促進鳶尾組培苗的生根生長有關(guān)?？梢姡砑覲P333后，組培苗株高被抑制，反而促進了根系的生長，但組培苗生根現(xiàn)象是否會影響種質(zhì)保存的時間，以及是否會引發(fā)植株變異，還需進一步研究。

綜合存活率、黃葉率、增殖倍數(shù)、株高及隸屬函數(shù)評價結(jié)果，有髯鳶尾1A組培苗的種質(zhì)離體保存最佳處理為G4，即甘露醇40.0 g/L的處理，組培苗接種120 d時，株叢存活率為100%，無黃葉現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為2.9，株高為2.6 cm。

另外，鳶尾離體種質(zhì)保存在鳶尾種質(zhì)資源研究中尚屬首例，本研究僅對有髯鳶尾1A組培苗接種120 d的離體保存效果進行了探索，后續(xù)將在更長時間的種質(zhì)保存與恢復(fù)方面進行深入研究。