左德筠，王霄霄，王海霞*

（大連大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 大連 116622）

疾病會導(dǎo)致生物體液和組織中分子指紋圖譜發(fā)生改變，這些變化可以通過分析基因組、蛋白組或者代謝組的成分來衡量。蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析提供了檢測疾病發(fā)生的方法，基因分析能找出個體患某些疾病的傾向，并有助于評估長期風(fēng)險。因此，直接測定基因、蛋白質(zhì)和代謝物對于認識疾病和正常狀態(tài)的生物過程至關(guān)重要[1]。

1 代謝與代謝組學(xué)

1.1 代謝

代謝是最基本的生命活動，是機體最基礎(chǔ)的物質(zhì)來源和能量來源，同時也與細胞的各種物質(zhì)活動和功能密切相關(guān)[2]。代謝組學(xué)是生理病理等基礎(chǔ)研究的重要研究部分和內(nèi)容。代謝過程處于生命活動的中端，即使在基因和蛋白質(zhì)層面發(fā)生很微小的變化，這些微小變化都會在代謝層面放大，所以大家認為這些代謝這些代謝物的變化可以直接更靈敏的反應(yīng)機體的狀態(tài)和體征改變，所以它是機體狀態(tài)很好的指征和指標(biāo)。生物標(biāo)志物是指某種疾病機體體液或者組織中過度表達的物質(zhì)，可以是單核苷酸、核酸甲基化、mRNA、蛋白質(zhì)或相關(guān)代謝小分子這些物質(zhì)的變化與疾病特征相關(guān)。生物標(biāo)志物可以用于檢測疾病生物學(xué)行為和預(yù)測臨床結(jié)果。生物標(biāo)志物應(yīng)該具有疾病特異性，并且受環(huán)境條件或生理因素干擾少。并且易于測量靈敏度和特異度要高。

發(fā)現(xiàn)新的代謝標(biāo)志物的關(guān)鍵依賴于定量測定疾病組和正常對照組樣品中某些或某種代謝物的變化。疾病能引起機體組織和器官的病理變化，因此作為承擔(dān)細胞基本功能的蛋白質(zhì)及其代謝小分子也會發(fā)生相應(yīng)改變。這些改變可以體現(xiàn)在濃度、細胞的特定部位、相互作用和活性等方面的差異。代謝物的變化和某種疾病之間的相關(guān)性就需要進行精準(zhǔn)的定量測量，這對于樣本具有一定的統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是對生物樣品多個組混合物的定量分析，描述生物體內(nèi)多種代謝物質(zhì)動態(tài)變化的新興科學(xué)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要領(lǐng)域。雖然蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的巨大進步為調(diào)節(jié)細胞生理過程及病理因素提供了大量的信息，但是深入研究生物系統(tǒng)的功能是通過代謝物濃度和通量來得到的。定量檢測基因轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)最終代謝小分子產(chǎn)物，為代謝途徑形成的生化網(wǎng)絡(luò)及其所發(fā)揮的功能提供了重要信息，為進一步闡明疾病的發(fā)病機制提供證據(jù)。

2 基于質(zhì)譜的代謝物鑒定

2.1 質(zhì)譜

許多先進的分析的方法用于生物樣品的復(fù)雜混合物分析，包括血清、血漿、尿液、細胞和組織等。兩種最常用的方法是質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR）波譜。它們在代謝物鑒定和濃度測定方面提供互補。由于實驗應(yīng)用的是質(zhì)譜分析技術(shù)，因此在這里具體介紹MS分析。

MS具有高靈敏度（通常是皮克級）和數(shù)據(jù)采集速度，因此是代謝組學(xué)最常用的分析工具之一，它能檢測超過一千種代謝物特征。其鑒定手段主要基于保留時間、分子量和質(zhì)譜碎片與純品的色譜圖和碎片信息的比較。近些年基于MS方法的研究大幅增長，MS技術(shù)包括四級桿、三重四級桿、飛行時間（TOF）、離子阱等質(zhì)譜分析儀[3]。先進的軟件系統(tǒng)結(jié)合大量數(shù)據(jù)庫更易于代謝分子的測定。由于樣品成分太過復(fù)雜，在進行MS定量分析之前，通常先分離目標(biāo)代謝產(chǎn)物。因此目前使用質(zhì)譜常與分離技術(shù)相結(jié)合，如液相色譜（LC）和氣相色譜（GC）[4]。MS與色譜聯(lián)合使用的分析平臺的建立證明其在代謝組學(xué)中是有效的。

2.2 代謝物鑒定方法

從MS獲得光譜數(shù)據(jù)是復(fù)雜的，需要用多元統(tǒng)計學(xué)分析方法。目前在代謝組學(xué)中，通過定量檢測體內(nèi)小分子代謝分子水平以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理方法是主成分分析（PCA），邏輯回歸和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等相關(guān)方法。PCA是無監(jiān)督的方法，常用與數(shù)據(jù)分析的初始階段。之后預(yù)測模型通常使用監(jiān)督方法，一般常用PLS-DA建立一個基于矩陣X相對于矩陣Y的回歸模型，這個模型包括了每個樣本的類別信息[5]。邏輯回歸廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，它有助于選擇出疾病組和對照組區(qū)別地代謝物。PLS-DA模型一般采用交互驗證，即先在內(nèi)部使用相同數(shù)據(jù)集，再在外部使用獨立數(shù)據(jù)集，這是為了避免過擬合。

我們可以采集疾病組和對照組樣本，應(yīng)用質(zhì)譜法對分析其血清中代謝產(chǎn)物；通過數(shù)據(jù)預(yù)處理、多維統(tǒng)計學(xué)分析（PCA、PLS-DA）在得到的代謝產(chǎn)物分子中選定差異有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝產(chǎn)物分子，并對其進行單維統(tǒng)計學(xué)分析，隨后與已知代謝組數(shù)據(jù)庫（XCMS、Melin、HMDB）進行比較，得到具有顯著差異的分子式以及所代表的代謝物質(zhì)名稱[6]。最后，將上述確定的差異代謝產(chǎn)物與已知代謝途徑庫比較，從中挖掘出與原發(fā)性高血壓相關(guān)的異常代謝物及代謝途徑即生物信息學(xué)分析[6]，進行顯著性差異代謝物通路分析（KEGG通路），獲得相關(guān)代謝標(biāo)志物。如圖：

3 展 望

基于MS定量代謝組學(xué)平臺的所有技術(shù)的迅速發(fā)展，如質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)庫搜索和實驗結(jié)果的生物學(xué)解釋，更方便于研究者使用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的人類疾病相關(guān)生物標(biāo)志物。但是，由于人體樣本具有異質(zhì)性和數(shù)據(jù)平臺的不統(tǒng)一性，使得研究人員面臨巨大的挑戰(zhàn)。分析復(fù)雜樣品的最佳途徑是密切結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究，開發(fā)綜合分析設(shè)施，以提高發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的可信度，并得以進行驗證。所以自動化設(shè)備的創(chuàng)新和發(fā)展是MS應(yīng)用于臨床代謝組學(xué)所必不可少的。