于芃，曹豐,2*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710032；2解放軍總醫(yī)院國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853)

美國心臟協(xié)會(American Heart Association，AHA)《心臟病與卒中統(tǒng)計數(shù)據(jù)(2018版)》報道[1]，全球每年因心血管疾病(cardiovascular diseases, CVDs)死亡的人數(shù)比所有癌癥和慢性下呼吸道疾病的總和還要多。CVDs最嚴(yán)重的形式是急性心肌梗死 (acute myocardial infarction,AMI), 死亡率高達(dá)12%[2]。AMI后生存患者中，缺血性損傷使大量功能心肌細(xì)胞死亡，造成心力衰竭。近年來，許多研究嘗試尋找再生功能性心肌細(xì)胞的新方法。主要是通過各種刺激，使梗死心肌細(xì)胞再生或提供能夠產(chǎn)生新的心肌組織來替代受損組織的細(xì)胞，達(dá)到恢復(fù)心臟功能的最終目標(biāo)。

干細(xì)胞(stem cell,SC)療法在功能性心肌細(xì)胞再生中表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)分泌的外泌體中富含微小核糖核酸22(micro ribonucleic acid 22,mi-RNA22)，通過旁分泌的形式作用于缺血/再灌注損傷后的心肌細(xì)胞，與甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，Mecp2)結(jié)合，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡、減輕心肌纖維化的作用。這表明MSC在心肌細(xì)胞損傷恢復(fù)中發(fā)揮的有益作用可能與其分泌外泌體有關(guān)[3]。近年來，許多科學(xué)研究確定了外泌體在分子水平診斷疾病、藥物遞送和疾病治療的作用。并證實外泌體在CVDs治療中可以通過信號傳遞途徑激活內(nèi)源性修復(fù)[4]。因此，外泌體療法可能是修復(fù)受損心肌、再生功能性心肌細(xì)胞的一個新方向。主要通過攜帶功能性miRNAs來調(diào)控細(xì)胞間的信息傳遞，達(dá)到再生功能性心肌細(xì)胞的目的[5]。本文主要對外泌體在心肌細(xì)胞損傷修復(fù)治療中的作用進(jìn)行綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特性

1.1 外泌體的生物發(fā)生

活細(xì)胞能夠分泌多種膜狀囊泡，主要包括外泌體(40～100 nm)、微泡(200～1 000 nm)及凋亡小體(500～5 000 nm)[6]。膜狀囊泡不僅依據(jù)直徑分類，其生成機(jī)制也不同。其中，外泌體的生物發(fā)生過程如下：在外界刺激下細(xì)胞通過內(nèi)吞作用形成早期核內(nèi)體的過程中，可以將細(xì)胞質(zhì)中小蛋白質(zhì)、DNA、miRNA 包裹在內(nèi)，形成晚期核內(nèi)體，此時也稱為多囊泡體；隨后，晚期核內(nèi)體與細(xì)胞膜融合，通過胞吐過程釋放出攜帶各種分子、蛋白質(zhì)、基因、miRNAs和酶的外泌體[7]。

1.2 外泌體：細(xì)胞間通訊信使

外泌體在釋放到體液循環(huán)后，可以向靶細(xì)胞遷移，一但被靶細(xì)胞吸收，外泌體就可以將從源細(xì)胞攜帶的各種分子和miRNA等轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞。細(xì)胞分泌的所有膜狀囊泡中，外泌體中miRNA最豐富，因此，外泌體可以作為將miRNA轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的一種轉(zhuǎn)運體。

外泌體可以通過轉(zhuǎn)移miRNAs等細(xì)胞活性因子至受體細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞通路[8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化進(jìn)程中，凝血酶激活的血小板源外泌體中，miRNA-223、miRNA-21水平明顯升高，通過抑制細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達(dá)，發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用，減少血栓形成。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后小鼠巨噬細(xì)胞源外泌體中miRNA-155水平明顯上調(diào)，通過抑制miRNA-155的表達(dá)，可以減少心肌損傷期間成纖維細(xì)胞增殖并抑制炎癥。因此，外泌體具有轉(zhuǎn)移非編碼RNA(包括miRNA和lncRNA)從源細(xì)胞到受體細(xì)胞的能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞表型及蛋白質(zhì)的表達(dá)，在心血管事件的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1.3 外泌體：CVDs的一種新型生物標(biāo)志物

在各種病理生理條件下，細(xì)胞分泌的外泌體包含不同種類的miRNAs、 RNAs、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)成分，使其具有成為潛在的疾病診斷生物標(biāo)志物的能力。目前，應(yīng)用生物信息學(xué)的方法可以鑒定外泌體中含有的大量miRNAs。許多研究表明急性心肌梗死和動脈粥樣硬化患者血液中提取的外泌體中存在特異性的miRNAs。

Boulanger等[11]指出，在冠心病患者中，循環(huán)外泌體含量明顯增多，特別是富含miRNA-199a和miRNA-126的亞群體，這說明外泌體具有成為冠心病生物標(biāo)志物的潛力。同時，Shalaby等[12]通過對不穩(wěn)定型心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死及非心臟源性胸痛患者進(jìn)行血清miRNA分析發(fā)現(xiàn)，與非心臟源性胸痛患者相比，不穩(wěn)定型心絞痛和非ST段抬高型心肌梗死患者的血清中miRNA-499和miRNA-210表達(dá)水平顯著增加，且與疾病3 h內(nèi)的發(fā)展速度呈正相關(guān)，說明miRNA-499和miRNA-210可以作為潛在的急診診斷急性冠脈綜合征并預(yù)測風(fēng)險程度的可靠生物標(biāo)志物。

Bi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在急性冠脈綜合征患者血清外泌體中，miRNA-208a的表達(dá)水平明顯增加，其表達(dá)量與患者Killip分級、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzymes MB,CK-MB)峰值、心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin,cTn)峰值呈正相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，miRNA-208a高表達(dá)患者的1年生存率顯著降低。同時，在AMI患者血清外泌體中多種miRNAs與梗死后心力衰竭的發(fā)生密切有關(guān)。Matsumoto等[14]在研究中指出，在已經(jīng)發(fā)生心力衰竭和心室重構(gòu)的AMI患者中，血清外泌體源miRNA-192、miRNA-194和miRNA-34a均明顯增高。

2 SC源外泌體在心肌損傷修復(fù)中的作用

不同種類的SC源外泌體可以傳遞不同的生物學(xué)信息，有心臟保護(hù)功能的外泌體可以來自骨髓MSC、胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等。目前已經(jīng)嘗試了移植SC或基于SC的細(xì)胞移植療法來治療心血管疾病的各種策略[15]。研究發(fā)現(xiàn)在修復(fù)或再生受損組織的過程中，起主要作用的并不是移植細(xì)胞本身，而是移植細(xì)胞的旁分泌因子。最近，許多研究證實了關(guān)于外泌體及其內(nèi)miRNAs在心血管系統(tǒng)中的細(xì)胞間通訊中的重要作用[16]。

骨髓MSC具有免疫抑制特性，而單獨應(yīng)用MSC源外泌體可以避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，增強(qiáng)對受損心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。Arslan等[17]發(fā)現(xiàn)對AMI小鼠心肌內(nèi)注射MSC源外泌體后，梗死面積減少45%，并減輕全身炎癥。同時，Ju等[18]研究表明，心肌內(nèi)注射MSC源外泌體可促進(jìn)小鼠心肌梗死模型中心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，縮小梗死范圍。這都說明在心肌梗死早期應(yīng)用MSC源外泌體治療可以起到心肌保護(hù)作用。人臍帶MSC源外泌體通過保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡，同時促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成來對缺血性損傷后的心臟進(jìn)行修復(fù)，而沒有外泌體的人臍帶MSC對心臟功能恢復(fù)幾乎沒有促進(jìn)作用，提示人臍帶MSC對心肌的修復(fù)是由外泌體介導(dǎo)的[19]。

Khan等[20]在胚胎SC源外泌體對梗死后心肌的保護(hù)作用的研究中發(fā)現(xiàn)，胚胎SC源外泌體具有促進(jìn)血管生成、提高心肌細(xì)胞存活、恢復(fù)心臟功能的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胚胎SC源外泌體中富含miRNA-294，其主要作用靶點為心臟祖細(xì)胞，促進(jìn)心臟祖細(xì)胞的增殖與存活。

3 SC源外泌體在CVDs診療中的新作用

在急性、慢性缺血模型和急性缺血再灌注損傷模型中，外泌體在大幅度縮小梗死面積、減少纖維化和相關(guān)的病理重塑、刺激血管生成和改變免疫功能等保護(hù)受損心肌方面發(fā)揮明顯作用[21]。

3.1 SC源外泌體：CVDs的一種新型治療方法

MSC源外泌體在免疫調(diào)節(jié)和心臟保護(hù)方面有著與MSC相同的特性[22]。在心臟再生研究中，使用SC源外泌體替代SC治療有以下幾個優(yōu)點：(1)這種新療法可以為靶細(xì)胞提供活性分子，如mRNA，miRNA和蛋白質(zhì)等，同時，這些分子可以通過對源細(xì)胞操縱等外部手段進(jìn)行修飾；(2)相比輸注SC，單獨輸注SC源外泌體可以降低免疫排斥反應(yīng)。美中不足的是，由于外泌體分離提純過程比較復(fù)雜且效率較低，同時缺乏再生能力，半衰期短，外泌體可能僅具有短期益處。Takahashi等[23]研究表明，小鼠黑色素瘤B16-BL6細(xì)胞外泌體很快從血液循環(huán)中消失，半衰期約為2 min，這也限制了其治療疾病的能力。

3.2 SC源外泌體：CVDs治療的一種新型藥物載體

外泌體是細(xì)胞自然分泌的膜性囊泡，具有穩(wěn)定性、生物相容性、生物屏障滲透性、低毒性和低免疫原性。越來越多的證據(jù)表明，外泌體含有的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、miRNA等可以作為信號分子的天然載體，通過旁分泌方式介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞，因此，可以通過修飾將特定的生物活性分子轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，在心血管疾病的治療中發(fā)揮重要作用[24]。通過對SC源外泌體的個性化修飾，可以使其在疾病治療中發(fā)揮作用，成為一種具有廣闊應(yīng)用前景的新型藥物載體。

基于外泌體的治療方法是新興的一種納米治療手段。其生物學(xué)基礎(chǔ)是將特定miRNAs整合到外泌體中，傳遞給靶向細(xì)胞，促進(jìn)血管生成和心肌再生，發(fā)揮保護(hù)心臟、減少炎癥和抑制動脈粥樣斑塊形成的作用。同時，外泌體可以遞送一些蛋白調(diào)節(jié)劑(如Shh蛋白調(diào)節(jié)劑、形態(tài)發(fā)生蛋白等)，促進(jìn)心肌梗死后心臟血管再生，發(fā)揮抗凋亡和血管保護(hù)作用[25]。

在目前研究中，使用外泌體作為納米載體的主要途徑包括3種。(1)直接對源細(xì)胞外泌體加載治療性藥物；(2)通過對源細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，使外泌體中含有治療性藥物；(3)利用活性化合物轉(zhuǎn)染源細(xì)胞，上調(diào)其分泌外泌體中某種目標(biāo)分子的含量[26]。然而，到目前為止，這些方法都沒有在疾病治療的臨床轉(zhuǎn)化中得到驗證。

4 總結(jié)與展望

SC源外泌體的研究為心肌修復(fù)提供了一種新的無細(xì)胞治療手段，同時為心血管疾病治療開拓了新的領(lǐng)域。外泌體對生理和病理過程的影響,以及對心臟再生的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究，以證實它們既是疾病診斷的生物標(biāo)志物，也是治療心血管疾病的不錯選擇。大量實驗表明SC源外泌體對心血管疾病具有極大的治療潛力，可以克服單純SC治療的不足，為心臟再生領(lǐng)域提供了一把利器。但是SC源外泌體治療心血管疾病的臨床轉(zhuǎn)化仍處于起步階段，還需進(jìn)一步探索。