徐虎，范利，曹豐

(1解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心心血管內(nèi)科，北京 100853；解放軍總醫(yī)院：2第二醫(yī)學(xué)中心，4轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 100853；3解放軍總醫(yī)院國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853)

目前心血管疾病仍然是全球范圍內(nèi)人類主要的死亡原因。早期再灌注是治療缺血性心臟病最有效的策略，但冠狀動脈血管在一定時間重新獲得再通時，由于自由基生成增多、鈣超載、炎癥反應(yīng)等原因，會出現(xiàn)缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷。褪黑激素主要是由哺乳動物和人的松果體產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)睡眠、免疫、抗氧化、抗腫瘤等作用，已經(jīng)被證明可以保護(hù)心臟、預(yù)防I/R損傷，其機(jī)制主要是清除自由基和上調(diào)抗氧化系統(tǒng)，以及調(diào)控受體介導(dǎo)的信號通路等。本文將從心臟開始缺血到再灌注期間，對褪黑激素誘導(dǎo)心肌保護(hù)的相關(guān)作用機(jī)制及其臨床應(yīng)用和前景進(jìn)行闡述。

1 褪黑激素受體概述

在哺乳動物中褪黑激素可通過激活至少兩個高親和力的G蛋白偶聯(lián)受體MT1和MT2發(fā)出信號。研究發(fā)現(xiàn)Luzindole作為一種褪黑激素受體阻滯劑可以去除褪黑激素的心肌保護(hù)作用，由此認(rèn)為MT1和MT2受體在心肌保護(hù)作用中可能具有重要意義[1]。MT3受體是褪黑激素的低親和力受體，與褪黑激素的結(jié)合位點(diǎn)是醌還原酶2(quinone reductase 2,QR2)，該酶在平衡自由基生成中發(fā)揮重要作用。目前研究多認(rèn)為MT3受體可能也參與了褪黑激素對大鼠的心肌保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚待闡明。另外，

維甲酸相關(guān)孤核受體(retinoid acid receptor related orphan receptor,ROR)也是褪黑激素的受體。He等[2]發(fā)現(xiàn)，在小鼠I/R損傷后，ROR α亞型缺乏會顯著增加心肌梗死面積、促進(jìn)凋亡，加重心功能障礙，同時還能逆轉(zhuǎn)褪黑激素的心肌保護(hù)作用。由此可見，ROR在褪黑激素心肌保護(hù)中發(fā)揮著重要作用。除此之外，腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor 2,TNFR2)和toll樣受體(toll like receptor,TLR)也參與了褪黑激素的心肌保護(hù)作用。筆者考慮褪黑激素是通過激活TNFR2或TLR4(或均激活)以激活下游生存活化因子增強(qiáng)(survivor activating factor enhancement,SAFE)信號通路來介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用[3,4]。

2 褪黑激素心肌保護(hù)作用機(jī)制

2.1 相關(guān)信號通路

褪黑激素受體激活后，可通過復(fù)雜的信號通路引發(fā)一系列下游事件，如可抑制蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)，激活PKC和磷脂酶C，使有絲分裂原活化蛋白激酶的激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase1,MEK1) 和MEK 2磷酸化增加，促進(jìn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1(extracellular-signal-regulated kinase 1,ERK 1)和ERK2磷酸化增加，從而上調(diào)心臟中PKB、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT-3)和Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)的表達(dá)。Genade等[5]發(fā)現(xiàn)，褪黑激素還可以顯著抵消異丙腎上腺素強(qiáng)大的β-腎上腺素能刺激，發(fā)揮抗腎上腺素能效應(yīng)。具體地，褪黑激素發(fā)揮心肌保護(hù)作用的通路可概括為以下幾種。(1)再灌注損傷救助激酶通路。褪黑激素可通過再灌注損傷救助激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用。Tong等[6]首次證實在心肌保護(hù)中需要PKB活化。Amanda等[7]發(fā)現(xiàn)褪黑激素治療引起的心臟梗死面積減小與PKB和ERK激活、促凋亡的絲裂原激活蛋白激酶p38(p38 mitogen-activated protein kinasep 38,MAPK p38)失活有關(guān)。除此之外，RISK通路的下游效應(yīng)物還包括核糖體蛋白S6(p70S6)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和PKC的活化等。(2)SAFE或JAK/STAT通路。SAFE或JAK/STAT通路的下游效應(yīng)分子包括許多參與細(xì)胞存活的蛋白，如脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、細(xì)胞周期蛋白D1等。Yang等[8]證實褪黑激素心肌保護(hù)作用可被JAK/STAT通路的抑制劑AG490或JAK2 siRNA阻斷。(3)沉默信息調(diào)控因子通路。沉默信息調(diào)控因子(silent information regulator,Sirt)，尤其是Sirt1和Sirt3，在褪黑激素誘導(dǎo)心肌保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用。Sirt1通過對核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、PKB、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor O,FoxO)、p53、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPAR-α)、硫氧還蛋白1(thioredoxin-1,Trx1)等去乙?；饔谜{(diào)節(jié)脂肪酸氧化、心臟肥大、凋亡、氧化應(yīng)激和自體吞噬[9]。Ding等[10]研究發(fā)現(xiàn)褪黑激素的心肌保護(hù)作用依賴于Sirt1和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC-1α)。同時Han等[11]研究表明褪黑激素促進(jìn)脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cell,AD-MSCs)對心肌梗死的治療，可能是通過Sirt1信號通路防止AD-MSCs缺氧/血清剝奪(hypoxia and serum deprivation,H/SD)損傷，以促進(jìn)AD-MSCs的存活。對于Sirt3，其預(yù)防心肌I/R損傷可能是通過線粒體蛋白的去乙?；{(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的開放、凋亡和細(xì)胞存活實現(xiàn)的。另外，Sirt3還能使FoxO3去乙?；瑢?dǎo)致錳超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,MnSOD)和過氧化氫酶的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，抑制心肌肥大[12]。但Sirt信號通路與RISK、SAFE通路之間是否存在聯(lián)系，以及這些信號通路是否相互獨(dú)立地被激活，還有待進(jìn)一步闡明。(4)Mst1通路。Mst1是哺乳動物中Hippo通路的主要成分，具有促凋亡作用，可通過磷酸化直接抑制Sirt1的去乙?；饔?。Hu等[13]發(fā)現(xiàn)褪黑激素可通過抑制Mst1的磷酸化促進(jìn)心肌梗死后Sirt1的表達(dá)，顯著減輕心肌梗死后不良的左室重塑，因此Mst1/Sirt1信號可能是褪黑激素的下游靶點(diǎn)。此外，Mst1在糖尿病心肌病的心肌重塑中也發(fā)揮重要作用。Zhang等[14]研究表明，褪黑激素對糖尿病心肌病的有益作用歸因于Mst1磷酸化的抑制和Sirt3表達(dá)的增加。(5)Notch通路。Yu等[15]發(fā)現(xiàn)，褪黑激素的干預(yù)增加了Notch1、Hes1和PKB的表達(dá)，而Notch1通路激活PKB具有褪黑激素受體依賴性，因此褪黑激素誘導(dǎo)的RISK通路激活可能部分依賴于Notch 1通路。(6)Nrf通路。Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，與DNA抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合后可調(diào)控許多抗氧化反應(yīng)基因。研究認(rèn)在為I/R中褪黑激素的有益作用與Nrf2通路的激活密切相關(guān)[16]，但Nrf2通路是否與褪黑激素核受體或其他受體以及其他信號通路相關(guān)仍有待闡明。

2.2 褪黑激素與線粒體

褪黑激素可通過抑制MPTP的開放發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑激素激活的SAFE通路中STAT-3可以抑制MPTP的開放[17]，而STAT-3作用的發(fā)揮又依賴于線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶20(translocase of the outer membrane,TOM20)[18]。Pei等[19]發(fā)現(xiàn)褪黑激素對TOM70缺陷小鼠無心臟保護(hù)作用，說明TOM70對褪黑激素心肌保護(hù)作用的發(fā)揮至關(guān)重要。此外，能調(diào)節(jié)MPTP開放的糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)是RISK、SAFE等多種信號通路的共同靶點(diǎn)，近來也備受關(guān)注。

2.3 褪黑激素與抗炎

眾所周知，急性心肌缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷啟動了急性促炎癥反應(yīng)，釋放了各種促炎癥介質(zhì)。研究表明，TNFR2激活可增加p300/STAT-3/RelA/視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1(optical atrophy-1,OPA1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強(qiáng)線粒體融合，促進(jìn)呼吸活動，上調(diào)OPA1的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞[20]。鑒于褪黑激素對SAFE通路的影響，我們認(rèn)為褪黑激素也有可能激活了這一特殊通道。Ma等[21]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑激素可通過Sirt3/FoxO3a/Parkin信號通路誘導(dǎo)線粒體自噬，抑制動脈粥樣硬化病變中炎性小體NOD樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)的長期活化和白細(xì)胞介素1β的分泌，顯著減弱斑塊大小和易感性，從而改善動脈粥樣硬化的進(jìn)展。關(guān)于褪黑激素的抗炎作用，有研究已得出可靠的實驗室證據(jù)，但對于褪黑激素在I/R損傷過程中對心臟自身炎癥反應(yīng)的影響有待進(jìn)一步明確。

2.4 褪黑激素在心臟微血管中的作用

微血管I/R損傷是由內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、腫脹、微血管痙攣和毛細(xì)血管阻塞引起。褪黑激素可通過維持內(nèi)皮屏障功能、保持內(nèi)皮通透性、減少細(xì)胞過度氧化應(yīng)激和減輕內(nèi)皮依賴性NO的過度產(chǎn)生來保護(hù)微循環(huán)。Behram等[22]發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的心肌肥大與血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)的激活有關(guān)，糖尿病大鼠冠狀動脈血管中VEGF-A的磷酸化與正常大鼠比較顯著減少，給予褪黑激素治療后，磷酸化的VEGF-A顯著增加，防止了糖尿病心肌病的發(fā)生。Zhou等[23]發(fā)現(xiàn)褪黑激素通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)α亞基抑制了線粒體分裂-電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)-己糖激酶亞型2(hexokinase 2,HK2)-MPTP-線粒體自噬通路，從而保護(hù)了心臟微血管，并在后續(xù)研究中，Zhou等[24]發(fā)現(xiàn)褪黑激素通過恢復(fù)血小板中PPAR-γ的含量，顯著抑制了血小板的活化，進(jìn)而阻斷了線粒體FUN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)誘導(dǎo)的線粒體自噬，減弱了I/R損傷。這就表明，PPARγ/FUNDC1/線粒體自噬通路的調(diào)控可能是一種減輕I/R損傷的新途徑。

2.5 褪黑激素在病理條件下的作用

研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病大鼠中，Sirt1信號的減少加重了I/R損傷，褪黑激素干預(yù)后損傷減輕[25]。同時有研究在1型糖尿病動物中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)褪黑激素減輕I/R損傷的作用與激活A(yù)MPK-PGC1α-Sirt3信號通路有關(guān)[26]。眾所周知，糖尿病妊娠期間的氧化應(yīng)激會增加后代患產(chǎn)后疾病的風(fēng)險。Gao等[27]研究表明，與正常大鼠相比，糖尿病妊娠大鼠的后代顯示出更大的梗死面積、更嚴(yán)重的心臟功能障礙，具體機(jī)制是心臟胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)/PKB信號通路被抑制。但糖尿病妊娠大鼠接受褪黑激素治療后，IRS-1/PKB信號通路得到恢復(fù)，大鼠的后代對I/R損傷的耐受性也顯著提高。上述結(jié)果提示，母親糖尿病會使其子女成年后I/R損傷增加，這一現(xiàn)象可通過孕期褪黑激素治療加以預(yù)防，但確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步確定。

3 褪黑激素藥物應(yīng)用和臨床研究

褪黑激素在實驗動物身上取得的積極結(jié)果促使研究人員開始評估褪黑激素對人類的影響。有文章報道夜間褪黑激素分泌減少與心肌梗死發(fā)生率增加存在潛在聯(lián)系[28]，冠心病患者褪黑激素水平與健康人群比較顯著降低[29]。同時有研究證實褪黑激素不僅能降低健康受試者的血壓、血管反應(yīng)性和循環(huán)兒茶酚胺水平[30]，還能降低高血壓患者的血壓水平[31]。另外，兩項RCT試驗檢測了褪黑激素在大血管手術(shù)[32]和冠狀動脈搭橋手術(shù)[33]中的心臟保護(hù)作用。Gogenur等[32]將50例接受腹主動脈瘤手術(shù)的患者納入研究，在手術(shù)后第1天、第2天、第3天晚上，給予患者口服10 mg褪黑激素或安慰劑，發(fā)現(xiàn)接受褪黑激素治療的患者與安慰劑組比較心臟病發(fā)病率顯著降低(4%和29%，P=0.02)。Dwaich等[33]也報告了有利的結(jié)果，該研究納入45例冠狀動脈旁路移植術(shù)患者，并隨機(jī)分為安慰劑組、低劑量褪黑激素治療組(10 mg，口服，1/d)和高劑量褪黑激素治療組(20 mg，口服，1/d)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈搭橋手術(shù)前5 d給予褪黑激素(10或20 mg)顯著改善了患者的射血分?jǐn)?shù)，并以劑量依賴性的方式降低了血漿心肌肌鈣蛋白Ⅰ、白細(xì)胞介素1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和促凋亡蛋白caspase 3的表達(dá)。

目前有兩項臨床試驗(NCT00640094和NCT01172171)正在進(jìn)行，以測試褪黑激素對急性冠心病患者的療效[34，35]。在MARIA試驗(褪黑激素在急性心肌梗死血管成形術(shù)中的應(yīng)用)中，146例急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevated acute myocardial infarction, STEMI)患者在直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療期間隨機(jī)接受褪黑激素(靜脈和冠狀動脈內(nèi))或安慰劑治療，主要終點(diǎn)為梗死灶大小。結(jié)果顯示，在非限制STEMI人群中，褪黑激素與梗死面積的減少無關(guān)[34]。然而，為確定褪黑激素的效果是否受給藥時間的影響，研究者對數(shù)據(jù)進(jìn)行了事后分析，發(fā)現(xiàn)褪黑激素的作用是由再灌注的時機(jī)決定，即在癥狀出現(xiàn)2.5 h以內(nèi)給予褪黑激素可以減少40%的梗死面積[35]。因此，褪黑激素的給藥時間對于心肌保護(hù)的實現(xiàn)至關(guān)重要。

然而，到目前為止尚無研究確定保護(hù)人體心臟所需的最佳褪黑激素劑量。Dominguez-Rodriguez等正計劃進(jìn)行一項新的隨機(jī)臨床試驗，旨在確定褪黑激素對心臟死亡和心力衰竭住院治療的影響。但在得出最終結(jié)論之前，需要確定褪黑激素的最佳劑量。此外，最佳的給藥方式(口服、靜脈給藥、冠狀動脈內(nèi)給藥或聯(lián)合給藥)仍有待驗證。

4 臨床應(yīng)用前景

褪黑激素與其受體之間的相互作用需要進(jìn)一步評估，而褪黑激素在結(jié)合受體后發(fā)生的大量信號事件也需要進(jìn)一步探討。歐洲心臟病學(xué)會主張采用表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合的方法來尋找治療靶點(diǎn)[36]，為尋找褪黑激素誘導(dǎo)心肌保護(hù)的最終共同效應(yīng)物開辟新的可能?？傊?，只要褪黑激素在劑量、給藥方式和給藥時機(jī)等方面的問題得到解決，其臨床應(yīng)用前景就會值得期待。