■孔祎頔 鄭 偉，2 陳秀梅 劉洪健，3 單曉楓 陳玉珂 王桂芹*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.延邊州水產(chǎn)技術(shù)推廣站，吉林延邊133002；3.吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，吉林長(zhǎng)春130022）

谷氨酰胺 （Glutamine，Gln）是魚(yú)類(lèi)體內(nèi)含量最多的必需氨基酸，在代謝過(guò)程中至關(guān)重要，具有促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育、提高其抗病能力、改善腸道組成結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)免疫功能等作用（王桂芹等，2012）。同時(shí)，精氨酸 （Arginine，Arg）也作為魚(yú)類(lèi)體內(nèi)重要的功能性必需氨基酸，在參與機(jī)體蛋白質(zhì)、一氧化氮、多胺及肌酸的合成，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和免疫功能的提高等方面意義深遠(yuǎn)（王連生等，2017）。Gln受熱易分解生成有毒的焦谷氨酸和氨（徐奇友等，2009），但Gln二肽因其穩(wěn)定性好、水溶性高，已在畜禽生產(chǎn)（姜俊等，2004）和水產(chǎn)養(yǎng)殖（楊奇慧等，2008）等方面有應(yīng)用。在羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicus）（楊奇慧等，2008）、石斑魚(yú)（Epinephelussp）（Lin等，2005）、中華鱉（Trionyxsinensis）（溫安祥等，2008）、鮭（Salmoniformes）（陳巨星等，2004）等飼料中添加Gln，可提高生產(chǎn)性能、腸上皮細(xì)胞的增殖和分化、免疫功能和抗病和緩解免疫應(yīng)激的作用。團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）幼魚(yú)適宜生長(zhǎng)、氨基酸吸收以及魚(yú)體的免疫力和抗病原菌感染能力強(qiáng)的適宜精氨酸需求量為1.81%～2.35%（廖英杰等，2014）。提高斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietaluruspunctatus R）對(duì)愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）的抵抗力的適宜精氨酸需求量1.75%～2.45%（Tesser等，2005）、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的活性和血液中紅細(xì)胞的數(shù)目（PoMenz等，2014）。關(guān)于Ala-Gln和Arg共同添加對(duì)烏鱧生長(zhǎng)和免疫的影響至今沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)選取肉質(zhì)細(xì)嫩、口味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)的名優(yōu)土著品種烏鱧作為研究對(duì)象，探討在飼料中添加Ala-Gln和Arg最適添加量對(duì)烏鱧生長(zhǎng)和免疫功能的影響，為開(kāi)發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中Ala-Gln和Arg的共同使用的免疫添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及飼料

以魚(yú)粉為蛋白源，配制添加Ala-Gln（含量99%，北京萊瑞森醫(yī)藥科技有限公司）和Arg（含量99%，浙江省益萬(wàn)生物技術(shù)有限公司）的等氮等能（42.5%粗蛋白質(zhì)、18.5 MJ/kg）的七組飼料。Ala-Gln和Arg的添加梯度的設(shè)置原則是以Ala-Gln和Arg各自對(duì)烏鱧生長(zhǎng)的最適添加量（5.0 g/kg和20 g/kg）為100%，等比例添加0%、20%、40%、60%、80%、100%、120%（見(jiàn)表1）。飼料原料經(jīng)粉碎、稱重、混均、擠壓成直徑為1.5 mm的顆粒，曬干后，-20℃保存、備用。采用國(guó)標(biāo)法測(cè)定飼料中的水分、粗蛋白質(zhì)、粗灰分和粗脂肪，飼料配方見(jiàn)表2和表3。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)烏鱧購(gòu)于遼寧劉二堡漁場(chǎng)，試驗(yàn)前暫養(yǎng)于室內(nèi)玻璃水族箱中。暫養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)日糧（蛋白質(zhì)含量42%）馴化15 d。選取體質(zhì)健康、大小一致的烏鱧，體質(zhì)量為（9.56±0.24）g，試驗(yàn)開(kāi)始前，停食1 d。隨機(jī)分配到21個(gè)玻璃水族箱中，七個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30尾魚(yú)。每天09：00、16：00飽食投喂兩次。飼養(yǎng)8周，pH值為7.1±0.1，氨氮＜0.5 mg/l，水溫為23～30 ℃，溶解氧＞5.0 mg/l。

1.3 樣品收集及指標(biāo)計(jì)算

表2 試驗(yàn)飼料（%干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表3 試驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)組成（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

飼養(yǎng)8周后取樣，計(jì)算平均增重率、飼料效率、攝食率、蛋白效率及肥滿度，取側(cè)線上背鰭下的白肌，用于營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定。

平均增重率（%）=100×（Wt-W0）/W0

飼料效率（%）=100×（Wt-W0）/I

攝食率（%/d）=100×I/（W0+Wt）/2t

蛋白效率=（Wt-W0）/（I×C）

肥滿度（g/cm3）=（W/L3）×100

式中：I——攝入飼料的重量（g）；

t——試驗(yàn)時(shí)間（d）；

W0、Wt——試驗(yàn)初始和結(jié)束時(shí)烏鱧的總重量（g）；

C——飼料蛋白質(zhì)的含量（%）；

W、L——每尾魚(yú)的體重（g）和體長(zhǎng)（cm）。

1.4 抗氧化酶、免疫酶和細(xì)胞因子的測(cè)定

飼養(yǎng)8周，停食24 h，每缸隨機(jī)取10尾魚(yú)，用MS-222（200 mg/l）麻醉，尾靜脈采血，4 ℃靜置12 h，離心取血清，之后取頭腎、脾臟和肝臟，-20℃保存待測(cè)。分別采用黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法、比濁法、硝酸還原酶法、考馬斯亮蘭法、雙抗體夾心ELISA法、放射免疫分析法測(cè)定過(guò)氧化物歧化酶（SOD）活性、血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力（GSHPx）、溶菌酶（LZM）活性、一氧化氮（NO）含量、蛋白含量、血清中IL-1β水平、血清IL-2的含量。

1.5 攻毒試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組取60尾，三個(gè)平行，采用嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），活化后用無(wú)菌生理鹽水稀釋，按100 g魚(yú)體重0.1 ml腹腔注射菌液（菌液濃度為6×109cells/ml，是7 d內(nèi)魚(yú)死亡一半時(shí)的菌液濃度和注射劑量），觀察1周，統(tǒng)計(jì)烏鱧死亡率并計(jì)算其攻毒后存活率。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS（20.0）軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's多重比較進(jìn)行組間差異顯著性比較。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧生長(zhǎng)的影響（見(jiàn)表4）

由表4可知，飼料中Ala-Gln和Arg添加比例增加到60%時(shí)，烏鱧平均增重率顯著高于20%組、40%組和對(duì)照組（P＜0.05），但Ala-Gln和Arg添加比例在80%～120%時(shí)，烏鱧平均增重率不再提高，且各組之間差異不顯著。將飼料中Ala-Gln和Arg添加量的比例（X）和試驗(yàn)烏鱧平均增重率（Y）做拋物線回歸分析，所得方程為：Y=-76.907X2+110.50X+151.03，R2=0.892 4（Xmax=71.84%）。根據(jù)拋物線回歸分析結(jié)果與方差分析結(jié)合起來(lái)得出，烏鱧平均增重率在Ala-Gln和Arg添加比例為60%～71.84%時(shí)達(dá)到最大值，即Ala-Gln最適添加范圍為3.0～3.59 g/kg、Arg最適添加范圍為12.0～14.37 mg/kg。

表4 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧生長(zhǎng)及飼料利用的影響

由表4同時(shí)可知，飼料中Ala-Gln和Arg添加比例為20%～60%時(shí)，烏鱧飼料效率和蛋白效率隨其添加比例的增加而升高，且Ala-Gln和Arg添加比例為60%時(shí)，烏鱧蛋白質(zhì)效率和飼料效率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但是當(dāng)Ala-Gln和Arg添加比例在80%～120%時(shí)，飼料效率和蛋白質(zhì)效率均不再升高且各組之間差異不顯著（P＞0.05）。將Ala-Gln和Arg添加比例（X）和烏鱧蛋白效率（Y）做回歸分析為：Y=-0.339 8X2+0.467 3X+2.137 4，R2=0.901 2（Xmax=68.76%）拋物線回歸分析結(jié)果與方差分析結(jié)合起來(lái)得出，烏鱧最大蛋白效率的最適Ala-Gln和Arg添加比例為60%～68.76%，即Ala-Gln最適添加范圍3.0～3.40 g/kg、Arg最適添加范圍12.0～13.75 mg/kg。

2.2 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響（見(jiàn)表5）

表5 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響（%）

由表5可知，飼料中Ala-Gln和Arg的添加比例在20%～80%時(shí)，烏鱧肌肉中粗蛋白質(zhì)含量隨著其添加比例的增加呈上升趨勢(shì)，而飼料中Ala-Gln和Arg添加比例為80%時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但當(dāng)Ala-Gln和Arg添加比例為100%和120%時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量與對(duì)照組及其他試驗(yàn)組差異都不顯著（P＜0.05），且二者之間差異不顯著。烏鱧肌肉中的粗灰分、粗脂肪和水分各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧抗氧化酶、免疫酶和細(xì)胞因子的影響（見(jiàn)表6）

表6 Ala-Gln和Arg對(duì)血清和肝臟烏鱧SOD和GSH-Px的影響

由表6可知，血清和肝臟GSH-Px隨Ala-Gln和Arg的添加而增加。當(dāng)60%添加量時(shí)，血清和肝臟GSH-Px顯著高于對(duì)照組，添加120%組血清GSH-Px顯著高于20%、40%、60%組和對(duì)照組（P＜0.05），添加100%組肝臟GSH-Px顯著高于對(duì)照組和20%～60%添加組（P＜0.05），與80%和120%添加組差異不顯著。血清和肝臟SOD隨Ala-Gln和Arg的添加而增加，120%添加組的血清SOD顯著高于對(duì)照組和20%、40%組（P＜0.05），80%添加組的肝臟SOD顯著高于對(duì)照組、20%和40%添加組，與60%、100%和120%添加組差異不顯著。

Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧頭腎和脾臟的LZM活性和NO含量的影響見(jiàn)表7。頭腎和脾臟的LZM活性都有隨Ala-Gln和Arg的添加出現(xiàn)先升高后降低或平穩(wěn)的趨勢(shì)，20%添加組的頭腎LZM活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），40%添加組的頭腎LZM活性顯著高于對(duì)照組和20%添加組（P＜0.05），與60%添加組差異不顯著。80%～120%添加組的頭腎的LZM活性差異不顯著。20%～60%添加組脾臟的LZM活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），80%～120%添加組差異不顯著；頭腎和脾臟的NO含量都隨Ala-Gln和Arg的添加量的增加先升后降，60%添加組的頭腎和脾臟NO含量都顯著高于其他各組和對(duì)照組（P＜0.05）。

表7 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧頭腎和脾臟LZM活性和NO含量的影響

Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧血清PBL的IL-1β和IL-2以及攻毒存活率的影響見(jiàn)表8。IL-1β隨Ala-Gln和Arg的增加而降低，60%添加組的IL-1β顯著低于對(duì)照組、20%和40%添加組（P＜0.05），但與80%～120%添加組差異不顯著。IL-2隨Ala-Gln和Arg的增加先增加后降低，且在80%添加組達(dá)到最大值，各試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。攻毒存活率隨Ala-Gln和Arg的增加而升高，60%添加組的攻毒存活率顯著高于對(duì)照組、20%～40%添加組（P＜0.05），與80%～120%添加組差異不顯著（表8）。

表8 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧血清PBL的IL-1β和IL-2以及攻毒存活率的影響

3 討論

3.1 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧生長(zhǎng)、飼料利用和營(yíng)養(yǎng)成分的影響

在飼料中適量添加Ala-Gln，可有效促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、飼料利用和蛋白質(zhì)的合成。在德國(guó)鏡鯉（Cyprinus carpio L.）日糧中添加0.75%Ala-Gln能顯著提高其生長(zhǎng)、飼料利用和蛋白質(zhì)的沉積（朱青等，2009）。

Gln可以提高大鼠游離甲狀腺素T3和T4含量，通過(guò)上調(diào)小腸黏膜細(xì)胞IGF-ImRNA的表達(dá)量以增加IGF-I自分泌和旁分泌，以致促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，從而提高生長(zhǎng)性能（謝建新等，2001）。對(duì)軍曹魚(yú)（Rachycentron canadum）幼魚(yú)（14.7 g）（趙紅霞等，2007）、團(tuán)頭魴（2.6 g）（廖英杰等，2014）、雜交條紋鱸（Moront Saxatuis）（Chang等，2012）、印度鯰（Kryptoglanis）（Khan等，2012）等的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用、蛋白質(zhì)沉積和免疫力提高的精氨酸含量分別是2.38%（占飼料蛋白的5.17%）、1.81%、1.0%、1.75%。石斑魚(yú)日糧Arg含量在2.01%～3.08%時(shí)，肌肉中粗蛋白質(zhì)含量隨著Arg增加而升高（Zhou等，2012）；在斑點(diǎn)叉尾鮰飼料中添加1.5%～2.5%Arg，可見(jiàn)Arg含量與魚(yú)體粗脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)與水分含量也呈負(fù)相關(guān)（Khan等，2012）。在本試驗(yàn)中，Ala-Gln和Arg添加比例為60%添加組和80%添加組比100%添加組（即分別添加Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧的最適添加量）效果顯著，隨著Ala-Gln和Arg添加比例的增加，烏鱧攝食率、蛋白質(zhì)效率和飼料效率顯著提高，說(shuō)明飼料中添加Arg和Ala-Gln能有效提高飼料蛋白質(zhì)的利用率，從而促進(jìn)烏鱧生長(zhǎng)。

3.2 Ala-Gln和Arg對(duì)烏鱧免疫和抗病的影響

Gln能夠有效提高機(jī)體抗應(yīng)激能力，主要表現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)代謝、提供能量、抑制病菌和抗氧化等方面。Gln二肽可提高日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）（葉均安等，2009）、哲羅魚(yú)（Hucho taimen）（徐奇友等，2009）的抗氧化能力，緩解應(yīng)激造成的過(guò)氧化損傷，從而利于生長(zhǎng)。同時(shí)，Gln的免疫調(diào)節(jié)作用一方面作用于炎癥早期，抑制促炎因子TNF、IL-1、IL-6的過(guò)多產(chǎn)生，從而避免過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)；另一方面可作用于補(bǔ)償期，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及IL-2的產(chǎn)生，避免促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生而造成的免疫抑制。此外，T淋巴細(xì)胞分泌lL-2及其受體的表達(dá)也依賴于外源性Gln的補(bǔ)充（Crawford等，1985）。持續(xù)應(yīng)激時(shí)，巨噬細(xì)胞內(nèi)Arg被大量用于NO的生成而導(dǎo)致缺乏，因一氧化氮合酶（NOS）直接催化精氨酸產(chǎn)生NO，Gln可促進(jìn)NOS基因的表達(dá)，Gln可促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌NO，間接調(diào)節(jié)Arg的需求量以致使NO的生成，因此，飼料中必須補(bǔ)充足夠的Arg和Ala-Gln。Ala-Gln可顯著提高日本對(duì)蝦血清中的LZM活性（葉均安等，2009）。在團(tuán)頭魴（2.6 g）飼料中添加2.35%Arg，其幼魚(yú)的免疫力和抗病原菌感染能力均達(dá)到最高（廖英杰等，2014）；添加1.0%Arg能顯著提高雜交條紋鱸血清LZM活性，顯著提高細(xì)胞外超氧陰離子和中性粒細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生（Chang等，2012）；斑點(diǎn)叉尾鮰接種愛(ài)德華氏菌7 d后，添加4%Arg組血清愛(ài)德華氏菌抗體效價(jià)顯著提高，14 d后顯著提高對(duì)愛(ài)德華氏菌的抵抗能力（Pohlenz等，2012）；在日糧中添加2%Arg能顯著提高斑點(diǎn)叉尾鲴感染愛(ài)德華氏菌后的成活率（Buentello等，2007）。本試驗(yàn)飼料中添加Ala-Gln和Arg可通過(guò)影響血清和肝臟的SOD和GSH-Px含量，提高其抗氧化功能，通過(guò)影響頭腎和脾臟的LZM活性和NO含量以提高其免疫力，通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β和IL-2來(lái)提高其抗炎活性，通過(guò)影響攻毒存活率來(lái)提高抗病能力，具有顯著的免疫和抗病保護(hù)作用。

4 結(jié)論

綜上所述，在飼料中添加Ala-Gln和Arg在一定程度上可以有效促進(jìn)烏鱧生長(zhǎng)、飼料利用和提高抗氧化、免疫保護(hù)的能力，建議具體Ala-Gln和Arg的適宜添加范圍為3.0～3.4 g/kg和12.0～13.75 mg/kg。