■張 娟 孫國平 韓 帥 閆素梅

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

阿爾巴斯白絨山羊是世界著名的絨肉兼用型品種，所產(chǎn)羊絨以細、長、柔軟著稱，素有“纖維寶石”之美譽，一直以來是飼養(yǎng)絨山羊主要的經(jīng)濟增長點[1]，然而，近幾年羊絨價格的下跌導致了山羊育肥成為了新的經(jīng)濟增長點。在絨山羊的飼養(yǎng)過程中，大量被淘汰的母羊和羔羊被用來育肥做肉用。相關文獻報道每年留作種用的羔羊僅30%，且每年淘汰30%左右成年羊作育肥用，成為羊肉的主要來源[2-3]?，F(xiàn)如今，生態(tài)環(huán)境極具脆弱與敏感，加上人為干擾，使生態(tài)環(huán)境問題越來越嚴峻，限制了放牧養(yǎng)殖，這就使得短期舍飼育肥成為了絨山羊育肥方式的新的關注點[4]。瘤胃發(fā)酵功能直接影響反芻動物的生產(chǎn)效率與產(chǎn)品品質(zhì)，育肥方式的改變會對日糧精粗比產(chǎn)生影響，且通過瘤胃微生物的變化對瘤胃發(fā)酵功能的影響較大，從而對育肥效果及肉品品質(zhì)等產(chǎn)生影響，但究竟如何影響尚不清楚。瘤胃是反芻動物特有的消化器官，反芻動物可通過瘤胃中細菌、原蟲和真菌發(fā)酵分解飼料進而獲得營養(yǎng)物質(zhì)[5]。楊蕾等[6]指出瘤胃中微生物與宿主之間存在互惠共生的關系，瘤胃中所含的26類、7 000多種菌之間的相互作用，影響蛋白質(zhì)、脂肪等沉積速率以及纖維素的降解速率，從而改善反芻動物消化功能，影響其肉品品質(zhì)。郭秀蘭[7]發(fā)現(xiàn)脂肪沉積與硬壁菌門呈正線性關系，與擬桿菌門呈負線性關系，這說明瘤胃內(nèi)菌群的變化會影響脂肪沉積，進而影響肉品質(zhì)及其風味。課題組前期就自然放牧與舍飼對絨山羊生產(chǎn)性能及肉品品質(zhì)的影響做了大量研究，結果表明舍飼可提高絨山羊飼料轉(zhuǎn)化效率、生產(chǎn)性能和屠宰性能，對理化特性并未產(chǎn)生不利影響，但影響羊肉的氨基酸與脂肪酸組成[1，3，8-9]，其機理尚不清楚。尹永志等[10]也提出羔羊瘤胃發(fā)育并不完善，而瘤胃微生物數(shù)量和結構的變化影響機體生理平衡，所以研究羔羊瘤胃內(nèi)菌群變化對預測其健康成長具有重要意義。本試驗旨在探究不同飼養(yǎng)方式對阿爾巴斯白絨山羊成年羊與羔羊瘤胃菌群的影響，為科學的制定阿爾巴斯白絨山羊成年羊與羔羊育肥方案，深入探討飼養(yǎng)方式對肉品品質(zhì)的影響機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗在內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊種羊場進行。試驗分2部分，均采用單因子完全試驗設計。試驗1將60只年齡、體重相近的淘汰成年母羊隨機分為2組，每組30只。一組為對照組，在天然草場進行自然放牧育肥；一組為試驗組，完全舍飼育肥，日糧采用全混合飼喂，自由采食，育肥期60 d，1～30 d為育肥前期，31～60 d為育肥后期。試驗2從內(nèi)蒙古白絨山羊種羊場的4月齡斷奶羔羊群中選擇日齡相近[（130±10）d]的去勢公羔60只分為2組，每組30只。一組為對照組，進行放牧補飼育肥，一組為試驗組，進行舍飼育肥。放牧補飼育肥的羔羊按照原廠方式，每天在天然草場上放牧并每只補飼玉米（風干基礎）300 g，舍飼育肥羔羊按照試驗設計的全混合日糧飼喂，各組羔羊均自由飲水。育肥時間為3個月，分育肥前期（1～30 d）、中期（31～60 d）和后期（61～90 d）三期。

1.2 日糧組成

對照組成年羊在天然草場進行自然育肥，采食牧草的主要營養(yǎng)物質(zhì)含量見表1；試驗組的日糧組成及營養(yǎng)水平見表2，日糧干物質(zhì)基礎的精粗比例在育肥前期為40∶60，育肥后期為45∶55。

表1 自然放牧成年母羊采食牧草營養(yǎng)水平（風干基礎）

表2 舍飼育肥母羊日糧組成和營養(yǎng)水平（風干基礎）

對照組羔羊在天然草場進行自然放牧補飼所采食牧草的主要營養(yǎng)物質(zhì)含量見表3；試驗組的日糧組成及營養(yǎng)水平見表4，日糧干物質(zhì)基礎的精粗比例育肥前期為40∶60，育肥中期和育肥后期為50∶50。

表3 放牧補飼育肥羔羊采食牧草營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 測試指標與方法

在試驗結束時，分別從對照組和試驗組中選擇6只羊、在禁食24 h、禁水2 h后屠宰，采集瘤胃液后立即混勻，將采集的瘤胃液裝入到凍存管內(nèi)，-80℃保存。

1.3.1 瘤胃中總DNA的提取

采用珠磨硯法從處理好的瘤胃液中提取瘤胃液微生物總DNA。DNA的純度、濃度與玻璃珠的用量和振蕩破碎細胞及蛋白質(zhì)的去除過程密切相關。加入酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）處理5 min，使蛋白質(zhì)徹底變性并將其完全去除，從而提高DNA產(chǎn)物的純度。加入氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提時，靜置后離心是使液面更加清晰，更好的吸取上清，以免蛋白污染。

1.3.2 引物設計、PCR反應體系及反應參數(shù)

引物設計及退火溫度詳見表5。

PCR反應體系為25 μl：模板（瘤胃液DNA）1 μl，目標基因上游、下游引物各1 μl,目標基因下游引物1 μl，DNA連接酶Mix 12.5 μl，ddH2O（無酶水）9.5 μl。PCR反應參數(shù)：94℃預變性5 min，95℃變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。目標菌株PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測后，均與預期擴增長度一致，可用于膠回收?；厥辗椒▍⒄湛禐槟z回收試劑盒（Gel Extraction Kit，康為世紀生物科技有限公司）的方法進行，產(chǎn)品號為Cat.No.CW0525。

表4 舍飼育肥羔羊日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

表5 PCR擴增引物

1.3.3 PCR擴增產(chǎn)物的克隆

按DNA Ligatiog Kit試劑盒說明，將PCR產(chǎn)物與pGM-T載體連接。連接體系為目的PCR片段7 μl、pGM-T 載體 1 μl、0×T4DNA Ligation Buffer 1 μl、T4DNA Ligase 1 μl，共 10 μl?？寺『笮枰c載體進行連接，為保證連接質(zhì)量，選擇輕彈混勻后16℃過夜。將10 μl連接產(chǎn)物加入到冰浴5 min融化好的100 μl TOP 10感受態(tài)細胞中，輕彈混勻后冰浴30 min，42℃水浴90 s后立即冰浴2～3 min，其間不要搖動離心管。向離心管中加入250～500 μl預熱的37℃的液體LB培養(yǎng)基（不含抗生素），150 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)45 min。將離心管中的菌液混勻，6 000 r/min離心5 min。棄去400 μl上清液，抽打混勻剩余菌液取100 μl涂布到含有IPTG、X-gal和含有相應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，無菌玻璃棒均勻的涂開后待平板表面干燥將平板倒置，37℃培養(yǎng)12～16 h。

1.3.4 陽性克隆菌藍白斑篩選及PCR鑒定

運用藍白斑篩選法篩選出陽性克隆菌，在LB固體培養(yǎng)基上隨機挑選白色菌落，將得到的白色菌落接種于1～5 ml LB培養(yǎng)基（含終濃度為50～100 μg/ml的氨芐青霉素）中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液做普通PCR鑒定，體系及模板量同上。選取經(jīng)PCR鑒定后的陽性克隆菌液，由中美泰和公司進行測序。測序結果在NCBI的Blast進行比對。

1.3.5 陽性克隆質(zhì)粒的小量提取及標線制備

對比對成功的陽性克隆菌進行質(zhì)粒的小量提取，按照質(zhì)粒小提試劑盒[TIANprep Mini Plasmid Kit，天根生化科技（北京）有限公司]說明步驟進行操作。用酶標儀測定質(zhì)粒的濃度，再根據(jù)公式計算陽性克隆質(zhì)粒的拷貝數(shù)：DNA（拷貝數(shù)）=DNA濃度（ng/μl）×6.02×1 023（拷貝/mol）/DNA長度（dp）×660 （g/mol.dp）。然后對已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒標準品做至少5個10倍梯度稀釋，每個濃度做三個重復，同時用無酶水做對照，用熒光定量PCR儀（BIO-RAD-IQ5TM）按如下體系操作：模板（待測樣DNA）1 μl，熒光定量用SYBR Green Ⅱ Mix 12.5 μl、目標基因上游引物、下游引物（10 μmol/l）各1 μl，ddH2O為9.5 μl制備標線。

1.3.6 實時熒光定量PCR分析

所測樣本用與上述相同體系及方法進行檢測。

1.3.7 瘤胃液的原蟲數(shù)量

采集的瘤胃液立即用兩層紗布過濾，取1 ml該濾液用4 ml MFS染液將原蟲固定，靜置30 min，常溫放置以備用。顯微鏡計數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)運用SAS 9.0軟件進行t檢驗，當P≤0.05時，表示組間差異顯著，當0.05＜P≤0.10時，表示組間差異趨于顯著，而P＞0.10表明組間差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 成年羊瘤胃液中的幾種微生物數(shù)量

表6 不同飼養(yǎng)方式對成年羊瘤胃液中總細菌、總產(chǎn)甲烷菌及三種纖維降解菌數(shù)量的影響（copy/ml）

表7 飼養(yǎng)方式對成年羊瘤胃液中反芻月型單胞菌、牛鏈球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和脂解厭氧弧桿菌數(shù)量的影響（copy/ml）

如表6與表7所示，與對照組相比，試驗組成年羊瘤胃液中的總產(chǎn)甲烷菌與反芻月型單胞菌趨于顯著增加，（P=0.06，P=0.09），牛鏈球菌趨于顯著降低（P=0.07），原蟲、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌與脂解厭氧弧桿菌數(shù)量顯著增加（P=0.01，P=0.05，P=0.05）。成年羊試驗組和對照組的瘤胃液總細菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌及嗜淀粉瘤胃桿菌間差異均不顯著（P＞0.10），但在數(shù)值上試驗組高于對照組。

表8 成年羊瘤胃液中的7種菌占總菌的百分比（%）

由表8列出了瘤胃液中的7種菌占總菌的比例。結果得出，試驗組的反芻月型單胞菌比例最高，顯著地高于對照組（P=0.03），纖維類降解菌中的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌比例次之，顯著高于對照組（P=0.03），脂解厭氧弧桿菌占比最低，但顯著高于對照組。對照組以嗜淀粉瘤胃桿菌比例最高，反芻月型單胞菌比例次之，脂解厭氧弧桿菌最低。

2.2 羔羊瘤胃液中的幾種微生物數(shù)量

表9 不同飼養(yǎng)方式對羔羊瘤胃液中總細菌、總產(chǎn)甲烷菌及三種纖維降解菌數(shù)量的影響（copy/ml）

表10 飼養(yǎng)方式對羔羊瘤胃液中反芻月型單胞菌、牛鏈球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和脂解厭氧弧桿菌數(shù)量的影響（copy/ml）

如表9、表10所示，與對照組相比，試驗組的羔羊瘤胃液總細菌數(shù)量顯著增加（P=0.003），總產(chǎn)甲烷菌及原蟲數(shù)量差異趨于顯著增加（P=0.08，P=0.09）；反芻月型單胞菌、白色瘤胃球菌與黃色瘤胃球菌數(shù)量呈上升趨勢，其他各菌雖然數(shù)值上略有降低，但均無顯著差異（P＞0.10）。

表11 羔羊瘤胃中7種菌占總菌的百分比（%）

如表11所示，羔羊瘤胃液中7種菌占總菌的比例在兩組間均無顯著差異（P＞0.05）,但對照組均略高于試驗組。對照組與試驗組瘤胃液細菌均以嗜淀粉瘤胃桿菌占比最高，產(chǎn)琥珀絲狀桿菌、白色瘤胃球菌次之，脂解厭氧弧桿菌最低。

3 討論

反芻動物與瘤胃微生物之間建立共生關系，動物通過這些微生物為飼料發(fā)酵提供營養(yǎng)和最佳環(huán)境條件，進而為宿主動物提供營養(yǎng)物質(zhì)。如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是嚴格厭氧型革蘭氏陰性菌，具有較強的纖維素降解能力。可將飼料中纖維物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生乙酸和琥珀酸。原蟲能夠?qū)㈩w粒性淀粉和葡萄糖等可溶性糖等碳水化合物轉(zhuǎn)變成支鏈淀粉并貯藏于其體內(nèi)，避免了其他細菌對淀粉和可溶性糖類的快速發(fā)酵，以保持瘤胃內(nèi)pH值的穩(wěn)定[16]。脂解厭氧弧桿菌可能是目前唯一的脂肪降解菌[17]。是以脂解厭氧弧菌受日糧結構影響較為明顯。周航[18]對延邊黃牛的研究中發(fā)現(xiàn)日糧精粗比對瘤胃微生物群落結構有很大影響。有相關研究表明，羔羊出生后2～4 d可在瘤胃中發(fā)現(xiàn)纖維分解菌，說明羔羊在采食固體飼料之前瘤胃中就已經(jīng)建立了纖維降解菌區(qū)系[19]。但建立后的細菌種群或整個微生物區(qū)系受日糧影響顯著，而Yá?ezrui等[20]也通過比較飼喂精料加粗料與僅飼喂粗料對斷奶前羔羊瘤胃細菌總數(shù)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的影響，說明了幼畜瘤胃微生物區(qū)系結構和菌群組成與飼糧類型相關。張海波等[21]及Zhang等[22]均表示隨著精補料能量增加，瘤胃原蟲數(shù)量增多，并提出精補料能量增加可能為原蟲的繁殖提供了充足的能量，有利于原蟲的繁殖。王夢芝等[23]也表示日糧結構（精粗比）影響瘤胃細菌和原蟲數(shù)量，本試驗中無論成年羊與羔羊，試驗組原蟲數(shù)量均顯著或趨于顯著的高于對照組，證明飼喂精料后，對原蟲數(shù)量有影響且有促進作用。課題組前期試驗表明完全舍飼顯著提高了成年羊瘤胃內(nèi)乙酸、丙酸水平[24]，本試驗中成年羊舍飼組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量相比放牧組也顯著增加，說明舍飼提高了瘤胃內(nèi)該菌的數(shù)量，進而使更多的纖維物質(zhì)被降解生成乙酸。有研究報道，飼喂高精料日糧可顯著增加反芻月型單胞菌的數(shù)量，進而提高了丙酸含量，這說明丙酸水平的變化可能與反芻月型單胞菌的數(shù)量有關[25-26]。本試驗研究結果表明，與對照組相比，舍飼組成年羊瘤胃內(nèi)反芻月型單胞菌顯著增加，這與上述報道一致。這可能是由于舍飼組的日糧營養(yǎng)水平高于對照組，進而增加了成年羊反芻月型單胞菌的數(shù)量。而對于羔羊來說，其瘤胃內(nèi)反芻月型單胞菌變化并不顯著，這可能是羔羊瘤胃微生物區(qū)系尚不完善的原因。反芻月型單胞菌既是乳酸利用菌[15]，也是丙酸生成菌[27]，據(jù)此可推斷該菌可能利用乳酸轉(zhuǎn)化為丙酸，提高瘤胃內(nèi)VFA的含量，這與本試驗結果也相吻合，VFA濃度過高，會導致pH降低，影響瘤胃發(fā)酵情況，但本試驗同期結果表明pH值在適宜范圍內(nèi)，說明VFA濃度雖然升高了，但并未對瘤胃發(fā)酵功能產(chǎn)生影響。

牛鏈球菌在牛瘤胃中存在廣泛，是瘤胃中主要的產(chǎn)乳酸菌和淀粉降解菌[28]，該菌可以產(chǎn)生活性較高的脲酶，在瘤胃非蛋白氮的分解中起重要作用。在趙培廳等采用逐漸提高飼糧精料比例的方式誘導奶山羊發(fā)生SARA過程中，發(fā)現(xiàn)牛鏈球菌的數(shù)量并未隨精料比例的改變出現(xiàn)較大變化，且占總菌比例較小[29]，這與本試驗結果一致。

產(chǎn)甲烷菌利用真菌、原蟲發(fā)酵過程中產(chǎn)出的H2將CO2還原成CH4，釋放到空氣中[20]；因此，產(chǎn)甲烷菌主要是在瘤胃中起到代謝H2的作用。羔羊在傳統(tǒng)模式飼養(yǎng)過程中其瘤胃中產(chǎn)甲烷菌和纖維降解菌很早就被建立起來[19]，且有研究也證明產(chǎn)甲烷菌可以影響產(chǎn)氫細菌和原蟲群落的數(shù)量[30]，而產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量會受日糧碳水化合物的影響。這一點在Johnson等[31]的研究中得到證實，研究指出，給動物飼喂可溶性糖比飼喂淀粉時瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量高。本試驗結果顯示，成年羊和羔羊舍飼育肥條件下相較于放牧或放牧補飼條件下產(chǎn)甲烷菌數(shù)量均增加，且差異趨于顯著，這是由于試驗期在秋季，對照組進行放牧育肥時飼草中粗纖維含量較高，且木質(zhì)化程度也偏高，牧草適口性差，導致動物采食量下降，瘤胃中不利于產(chǎn)甲烷菌的生長。而完全舍飼組的精料比例較高，可溶性碳水化合物含量高，營養(yǎng)均衡，利于產(chǎn)甲烷菌的生長繁殖，故舍飼組母羊與羔羊瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌數(shù)比對照組多。且羔羊產(chǎn)甲烷菌和纖維降解菌在10日齡即可達到與成年羊類似的水平[20]，這也可以解釋其菌群變化規(guī)律與成年羊相似這一現(xiàn)象。趙玉華[32]提出通過減少原蟲數(shù)量以減少產(chǎn)甲烷菌附著的載體，可有效減少產(chǎn)甲烷菌，所以原蟲數(shù)量與產(chǎn)甲烷菌數(shù)量變化趨勢相一致。原蟲數(shù)量的增加可能也是導致產(chǎn)甲烷菌數(shù)量上升的原因之一。

除產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌外，黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌能將纖維降解后產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，其中主要為木聚糖酶。楊宏波等[33]提出黃色瘤胃球菌與白色瘤胃球菌之間有相互抑制作用，可能是白色瘤胃球菌產(chǎn)生的細菌素抑制了黃色瘤胃球菌的生長，且證明這兩種菌的變化與日糧結構密切相關。本試驗中也發(fā)現(xiàn)白色瘤胃球菌數(shù)量始終高于黃色瘤胃球菌，這與馮仰廉試驗結果也相一致[17]。但本試驗中，不同的飼養(yǎng)方式對羔羊與母羊瘤胃中白色瘤胃球菌與黃色瘤胃球菌并無顯著影響。馬慧忠[34]在對絨山羊進行不同精粗比日糧對其瘤胃發(fā)酵影響的研究中也發(fā)現(xiàn)這兩個球菌的拷貝數(shù)發(fā)生變化，但組間差異并不顯著。日糧精粗比的改變對白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的相對表達量也沒有影響，這與本試驗結果也相類似。瘤胃主要纖維分解菌產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌只占總瘤胃細菌群落的10%以下，這與本試驗結果基本一致[35]。成年羊嗜淀粉瘤胃桿菌變化差異雖不顯著，但是舍飼組在數(shù)值上高于自然放牧組。這可能是由于嗜淀粉瘤胃桿菌具有降解淀粉的功能，所以有增加的趨勢。但精料水平并不足以引起牛鏈球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的劇烈變化。

本試驗結果顯示，舍飼條件與放牧條件下羔羊瘤胃中總菌數(shù)量差異顯著，而成年羊則無顯著差異，說明年齡對總菌數(shù)有影響，羔羊發(fā)育過程中瘤胃菌群可能還不完善，瘤胃內(nèi)環(huán)境還不太穩(wěn)定。成年羊試驗中，除原蟲數(shù)量、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量在兩種飼喂條件下數(shù)量差異顯著或趨于顯著，其他各菌差異均不顯著，這說明舍飼在成年羊上效果更為顯著。綜上所述，結合本試驗研究結果表明不同育肥方式下，日糧組成不同會對成年羊及羔羊瘤胃細菌數(shù)量及菌群變化產(chǎn)生不同程度影響，且從總體來看，放牧補飼增加了精料的飼喂但結合課題組同期其他方面研究，舍飼育肥較放牧促進了瘤胃微生物的生長，說明舍飼育肥方式可促進絨山羊育肥效果。這可能是舍飼育肥或補飼精料使絨山羊營養(yǎng)攝入更加平衡，且為菌群生長提供了必須能源，利于微生物的生長，從而更好的利用日糧中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進育肥效果。

4 小結

（1）舍飼育肥方式相較于放牧育肥會引起成年羊瘤胃中原蟲、產(chǎn)甲烷菌、反芻月型單胞菌、脂解厭氧弧桿菌數(shù)量顯著或趨于顯著升高，三種主要纖維降解菌中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著升高，而白色瘤胃球菌與黃色瘤胃球菌數(shù)量差異不顯著。

（2）相較于放牧補飼育肥組，羔羊在舍飼育肥組中總細菌量、原蟲數(shù)量與產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著或趨于顯著增加，而其他菌兩組間差異并不顯著。