■蔡云霞 楊 瑩 王 興 韓 晴 李 俊*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081；2.北京嘉博文生物飼料科技有限公司，北京100085；3.云南省獸藥飼料檢測(cè)所，云南昆明，650201）

根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，生物胺可分為：脂肪族，包括尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、胍丁胺等；芳香族，包括酪胺、苯乙胺、多巴胺等；雜環(huán)類，包括組胺、色胺等[1]。多種生物胺能夠與亞硝酸鹽反應(yīng)，生成強(qiáng)致癌物質(zhì)亞硝胺，因此生物胺亦被認(rèn)為有潛在致癌性[2]。其中，組胺毒性最大[3]，酪胺的毒性次之，尸胺和腐胺毒性較低，但能通過抑制組胺和酪胺的代謝酶活性，增加組胺和酪胺的潛在毒性[4]。而且生物胺之間還存在相互轉(zhuǎn)化，毒性也受到其他各類生物胺含量及胺類氧化酶的影響。

餐桌剩余食物富含大量的有機(jī)質(zhì)，主要由米面、蔬菜、肉蛋、骨頭、菜汁、油脂等組成，其主要成分包括蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、纖維素等有機(jī)物，還含有較豐富的礦物元素。餐桌剩余食物是一種潛在的飼料資源，可以替代部分蛋白及能量原料[5-6]。餐桌剩余食物在收集、儲(chǔ)運(yùn)過程中容易受微生物污染發(fā)生蛋白質(zhì)腐敗，腐敗過程中會(huì)持續(xù)產(chǎn)生生物胺。餐桌剩余食物中的生物胺含量與基質(zhì)的蛋白含量及其腐敗程度相關(guān)，生物胺可作為判斷餐桌剩余食物可飼料化利用的重要指標(biāo)。飼料化處理企業(yè)可首先利用感官判斷餐桌剩余食物的腐敗狀況，再結(jié)合腐敗進(jìn)程中所測(cè)的生物胺的值，判斷是否可以用于飼料化生產(chǎn)。

目前已經(jīng)積累了大量的生物胺的檢測(cè)方法，色譜法有薄層色譜法[7-8]、離子色譜法[9-10]和高效液相色譜法[11-13]等；其他還有毛細(xì)管電泳法[14]、生物傳感器法[15]等。其中高效液相色譜檢測(cè)法（HPLC）具有定量分析準(zhǔn)確，檢測(cè)靈敏度高，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，成為分析定量生物胺的主要檢測(cè)方法。生物胺檢測(cè)的衍生化階段，多數(shù)學(xué)者常選用丹磺酰氯、苯甲酰氯、鄰苯二甲醛（OPA）等作為衍生劑的柱前衍生。生物胺檢測(cè)的檢測(cè)器中，紫外檢測(cè)器是常用的一種檢測(cè)器，靈敏度較高；用高效液相色譜法搭配G1321A熒光檢測(cè)器檢測(cè)牙鲆體內(nèi)生物胺，最低檢出限達(dá)1.5 μg/l[16]；二極管陣列檢測(cè)器也有用于食品中生物胺的檢測(cè)[17]；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器不依賴于樣品的光學(xué)特性即可響應(yīng)，可以節(jié)省生物胺檢測(cè)需要的衍生過程[13]。

本文參考了動(dòng)物源性飼料的檢測(cè)方法（GB/T 23884—2009）[18]，餐廚廢棄物的反向高效液相色譜法[19]及水產(chǎn)品中生物胺的檢測(cè)方法[20]。作為需要批量檢測(cè)的條件下，在保證其準(zhǔn)確性的前提下要盡量簡化檢測(cè)的步驟。在動(dòng)物源性飼料中生物胺的檢測(cè)方法是針對(duì)均一性的魚粉進(jìn)行檢測(cè)。與魚粉相比，餐桌剩余食物在凍干粉碎后較魚粉油脂含量高，并且成分復(fù)雜，而毛文成建立的餐廚廢棄物的生物胺檢測(cè)方法中生物胺提取方式相對(duì)復(fù)雜，油脂粘壁的情況很明顯，不利于準(zhǔn)確計(jì)量生物胺含量，乙酸乙酯萃取效果較乙醚略差，因此本文對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了部分調(diào)整。

1 材料、儀器設(shè)備及試劑

1.1 材料

1.1.1 剛下餐桌的餐桌剩余食物

以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院職工食堂作為取樣點(diǎn)（表1）。取樣時(shí)利用長柄漏勺取樣器，在餐桌剩余食物收集桶的表面、上中部、下中部三個(gè)層，每層隨機(jī)設(shè)5個(gè)點(diǎn)，即每個(gè)桶內(nèi)取15個(gè)點(diǎn)樣，混合各點(diǎn)的樣品。剔除樣品中筷子、牙簽、餐巾紙、大塊骨頭等雜物，將樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后于模擬條件下進(jìn)行處理（下餐桌后約1～2 h）。

表1 餐桌剩余食物樣品采集登記

1.1.2 樣品制備

將收集的餐桌剩余食物分裝于3個(gè)6.0 L加蓋普通塑料桶中，30℃恒溫下處理72 h。分別于0、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)取混合樣測(cè)定。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣時(shí)，用玻璃棒（噴灑75%乙醇，紫外殺菌30 min）將桶中餐桌剩余食物充分?jǐn)嚢杌靹?，用漏勺（酒精棉擦拭，紫外照?0 min）取約600 g餐桌剩余食物，使用研磨儀研磨后，取一定量的樣品（約200 g）于9號(hào)自封袋中（紫外殺菌30 min），將自封袋中餐桌剩余食物壓平封口，在-80℃條件下預(yù)凍4 h以上，再進(jìn)行凍干處理。

將冷凍后的餐桌剩余食物樣品于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥約28～34 h至干。凍干后的餐桌剩余食物用粉碎機(jī)進(jìn)行無菌粉碎（紫外照射殺菌），并于-20℃下凍藏，用于各指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2 主要儀器

LC-15C高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器），日本Shimadzu公司；MG-2200型氮吹儀，日本Eyela公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Milli-Q Gradient MILLIPORE純水機(jī)，法國Milliq公司；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Himac CR-22G高速冷凍離心機(jī)，Hitachi公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；EYELA BATH SB-9電熱恒溫水浴鍋，日本Eyela公司。

1.3 主要試劑

酪胺鹽酸鹽（純度99.5%）、組胺鹽酸鹽（純度99.3%）、亞精胺鹽酸鹽（純度99.6%）、精胺鹽酸鹽（純度98.9%）、腐胺鹽酸鹽（純度99.0%）、尸胺鹽酸鹽（純度99.6%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純），德國Fisher公司；正己烷（色譜純），德國Fisher公司；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；苯甲酰氯（純度99%以上，北京化工廠）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的提取

稱取1.00～2.00 g樣品于50 ml具塞離心管中，加入20 ml 5%三氯乙酸溶液，渦旋振蕩1 min，振蕩提取30 min（轉(zhuǎn)速為200 r/min），將離心管離心10 min（4 000 r/min）。移取上清液5 ml至新離心管中，加入5 ml正己烷，渦旋振蕩2 min，靜置分層，離心5 min（3 000 r/min），棄去正己烷層備用。

2.2 樣品的衍生化

取2.00 ml提取液于10 ml具塞離心管中，向離心管中依次加入1 ml NaOH溶液（2 mol/l），20 μl苯甲酰氯，渦旋振蕩1 min，置于30℃恒溫水浴鍋中水浴40 min，每隔10 min渦旋振蕩30 s。加入2.00 ml飽和NaCl溶液中斷反應(yīng)，再加入2.00 ml乙醚進(jìn)行萃取，渦旋振蕩1 min后離心10 min（3 000 r/min），將離心管中的乙醚層移取至10 ml離心管中，重復(fù)萃取一次，將乙醚層合并至10 ml離心管中，用氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1.00 ml甲醇溶解殘?jiān)V（0.45 μm）后，濾液用于測(cè)定生物胺含量。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

精確計(jì)算并稱取6種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/l HCl溶液配制成1 mg/ml的單組分生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.2 混合儲(chǔ)備溶液

取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 ml，用0.1 mol/l HCl溶液定容至10 ml，形成單體生物胺質(zhì)量濃度為100 μg/ml的混合儲(chǔ)備液，4℃冰箱保存。

2.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)液

用0.1 mol/l HCl溶液將混合儲(chǔ)備液稀釋成濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生按“2.2”執(zhí)行，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 液相色譜分析條件

色譜柱：Venusil XBP C18柱（4.6 mm ×250 mm，粒度5 μm）；柱溫：35 ℃；紫外檢測(cè)波長254 nm；進(jìn)樣量：20 μl。流動(dòng)相：乙腈/水（V/V），梯度洗脫，設(shè)定梯度洗脫程序見表2；流速為1.0 ml/min。

表2 梯度洗脫程序

3 結(jié)果與分析

3.1 生物胺色譜圖與保留時(shí)間

選擇流動(dòng)相時(shí)分別嘗試了乙腈-水、甲醇-水，使用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，低濃度含量的生物胺圖譜離基線較遠(yuǎn)。用乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，7.5 min左右出峰，出峰時(shí)間合理，無拖尾現(xiàn)象。經(jīng)過梯度洗脫得到標(biāo)準(zhǔn)品圖譜（見圖1），6種生物胺在20 min內(nèi)得到了良好的分離，完全出峰，峰形對(duì)稱無拖尾現(xiàn)象，出峰時(shí)間集中在7～17 min之間。

圖1 20 μg/ml生物胺標(biāo)準(zhǔn)品圖譜（從左往右依次腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、組胺、酪胺）

3.2 線性范圍與檢測(cè)限

按照外標(biāo)定量法作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)（見表3）。以單個(gè)生物胺標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定信噪比作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，得到單胺的檢出限（S/N=3）與定量限（S/N=10）。

六種生物胺的峰面積與濃度在0.50～50.00 μg/ml線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.996；各生物胺的檢出限在0.1～0.5 μg/ml，定量限在0.4～1.0 μg/ml。

表3 6種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 加標(biāo)回收率與精密度

選擇新產(chǎn)生的餐桌剩余食物作為添加回收試驗(yàn)的樣品。稱取1.50 g新鮮餐桌剩余食物樣品4份，對(duì)照組不添加，其他添加水平分別為0.5、10 μg/ml和20 μg/ml，計(jì)算回收率，結(jié)果表明加標(biāo)樣品的平均回收率在50.36%～131.53%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤8.15%（n=6）（見表4）。

表4 加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

3.4 餐桌剩余食物的生物胺色譜圖與保留時(shí)間

由圖2所示，在實(shí)驗(yàn)室恒溫30℃儲(chǔ)存48 h的生物胺圖譜，6種生物胺均有檢出，在色譜圖上分離效果較好，按照標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖的保留時(shí)間確定生物胺類別，其中腐胺的峰值尤為突出，可見該批次餐桌剩余食物在避光30℃儲(chǔ)存48 h時(shí)，腐胺含量最高。

圖2 餐桌剩余食物中生物胺圖譜（從左往右，腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、組胺、酪胺）

3.5 恒溫儲(chǔ)存條件下生物胺含量的變化

餐桌剩余食物采集分裝完畢后，放置于30℃恒溫箱避光儲(chǔ)存，并于0、24、48、72 h均勻取樣，并檢測(cè)生物胺指標(biāo)含量（如圖3所示），在30℃恒溫避光條件下儲(chǔ)存的餐桌剩余食物的不同生物胺含量產(chǎn)生了一定的變化，其中腐胺隨著時(shí)間的增長而增長的趨勢(shì)比較明顯，從0～48 h之間腐胺高速增長，48 h時(shí)腐胺含量達(dá)218.25 mg/kg，之后增長速度明顯減緩，漸趨于穩(wěn)定，到72 h時(shí)腐胺含量為224.83 mg/kg。在細(xì)菌數(shù)量增長的同時(shí)，長時(shí)間的放置使得餐桌剩余食物生物胺含量增加，以腐胺增加為主，其次是組胺略有增加。

EFSA在聯(lián)盟范圍內(nèi)將魚制品中組胺含量制定為≤100 mg/kg。國內(nèi)GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定：高組胺魚類（鮐魚、竹莢魚等青皮紅肉海水魚）≤40 mg/100 g、其他海水魚類≤20 mg/100 g，而對(duì)其他食品未進(jìn)行限定。試驗(yàn)中經(jīng)72 h放置的餐桌剩余食物組胺為51.74 mg/kg，不超過國內(nèi)魚類衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步證實(shí)了餐桌剩余食物飼料化的可行性。但工業(yè)化生產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果會(huì)有差異，有研究顯示工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵醬油的生物胺含量高于實(shí)驗(yàn)室生物胺含量達(dá)10倍[21]，因此規(guī)?；a(chǎn)的日常監(jiān)測(cè)工作非常必要。

毛文成[19]對(duì)不同基質(zhì)的餐桌剩余食物在自然光照射的情況下腐敗進(jìn)程進(jìn)行研究，5種生物胺（腐胺、尸胺、精胺、組胺、酪胺）隨著時(shí)間的增長有升有降，但是尸胺的變化在米面類、油水類、肉菜類中均為增長最明顯的生物胺，38 h后迅速增加，最后趨于平緩，米面類餐桌剩余食物尸胺可達(dá)400 mg/kg，肉菜型高達(dá)800 mg/kg。毛文成[19]建議使用尸胺作為篩選餐桌剩余食物的特征性指標(biāo)。但本實(shí)驗(yàn)中腐胺的變化較其他幾種生物胺更明顯，尸胺的變化并不顯著，遠(yuǎn)小于50 mg/kg。因此生物胺的變化，除基質(zhì)不同以外還要考慮儲(chǔ)存條件的差異，直接選用尸胺作為特征性指標(biāo)通用性尚有待考證。

圖3 恒溫30℃儲(chǔ)存的餐桌剩余食物中6種生物胺含量的變化

4 結(jié)論

建立了一種高效液相色譜同時(shí)測(cè)定餐桌剩余食物中腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺6種生物胺含量的方法。利用三氯乙酸提取，以苯甲酰氯作為衍生劑，進(jìn)行樣品前處理，采用反相RP18色譜柱分離，乙腈-水作流動(dòng)相梯度洗脫，在波長254 nm進(jìn)行紫外檢測(cè)。結(jié)果6種生物胺在0.1～50 mg/kg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2＞0.996）。腐胺、尸胺檢測(cè)限達(dá)到0.1 mg/kg，精胺、亞精胺、組胺和酪胺檢測(cè)限為0.5 mg/kg。該方法簡便、快捷，可以用于餐桌剩余食物中6種生物胺的定性及定量測(cè)定。

將剛下餐桌的餐桌剩余食物加蓋后在30℃恒溫避光條件下儲(chǔ)存72 h，隨著儲(chǔ)存時(shí)間增加腐胺含量增長迅速，48 h后開始趨于平穩(wěn)，而尸胺等其他生物胺含量增長速度較緩慢，與餐桌剩余食物單批次的基質(zhì)構(gòu)成有關(guān)。應(yīng)同時(shí)檢測(cè)腐胺、尸胺及組胺等生物胺指標(biāo)來判定餐桌剩余食物的腐敗情況。