■管軍軍 張?zhí)煊?高天增 王志祥

（1.河南農(nóng)業(yè)大學畜牧學博士后科研流動站，河南鄭州450002；2.河南廣安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南鄭州450001）

單菌種發(fā)酵作為固態(tài)發(fā)酵中常見的一種發(fā)酵形式，該發(fā)酵能夠明確菌種的發(fā)酵效果，與混菌發(fā)酵相比，其工藝參數(shù)容易控制，且無菌種間的抑制作用。酵母菌體蛋白含量較高，約為50%～60%，氨基酸構成合理，且富含B 族維生素，是一種優(yōu)質的蛋白源。酵母菌發(fā)酵過程中能夠分泌大量水解酶類，降解抗營養(yǎng)因子，并產(chǎn)生多種生物活性物質。利用酵母發(fā)酵的飼料有抗病、強化營養(yǎng)和促進生長的效果。

但是，有關酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的研究鮮有報道。本課題組結合固態(tài)發(fā)酵飼料的產(chǎn)業(yè)化實際情況，在科學設計試驗方案的基礎上系統(tǒng)地研究酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料生產(chǎn)技術，本研究主要集中在發(fā)酵的工藝參數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)品主要營養(yǎng)指標（蛋白）的影響及工藝參數(shù)的優(yōu)化，為酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

酵母由河南省工業(yè)微生物菌種保藏中心提供，經(jīng)過篩選馴化后，并加以輔料經(jīng)冷凍干燥制成發(fā)酵劑（＞108CFU/g），冰箱5 ℃保存?zhèn)溆?。仔豬配合飼料551H及552H 由河南廣安生物科技股份有限公司生產(chǎn)，其組成如表1所示；另外，葡萄糖等試劑均為分析純，購自鄭州新豐化驗器材有限公司。

表1 仔豬配合飼料551H及552H配方

1.2 主要儀器設備

SPX-250B 智能型生化培養(yǎng)箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；JJ-CJ-1FD 超凈工作臺，吳江市凈化設備總廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FA2004B 電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 粗蛋白及其增加率的測定

利用凱氏定氮法GB/T6432—1994對仔豬配合飼料或發(fā)酵產(chǎn)品進行粗蛋白的測定，以干基表示(P)。

蛋白增加率(%)=（P發(fā)酵后-P未發(fā)酵）/P未發(fā)酵×100

1.4 發(fā)酵試驗

將酵母發(fā)酵劑接種到培養(yǎng)液[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸餾水]中，振蕩均勻，置于30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)，轉速為150 r/min，培養(yǎng)4 h。取發(fā)酵劑活化液一定比例（v/v）接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（仔豬配合飼料551H或552H與蒸餾水組成，裝料100 g/瓶）上。攪拌均勻后，置于培養(yǎng)箱中固態(tài)發(fā)酵，一定時間后取樣，50 ℃條件下干燥成品備用。

1.5 試驗設計

1.5.1 發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成、發(fā)酵溫度及接種量的影響試驗

試驗主要研究不同的發(fā)酵時間（0、12、16、24、32、40、48 h）、固態(tài)培養(yǎng)基組成[仔豬配合飼料∶水=（80∶20）、（70∶30）、（60∶40）、（50∶50）]、發(fā)酵溫度（25、28、30、32、35 ℃）及接種量（3%、5%、10%、15%、20%）對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響，其它因素還有培養(yǎng)基的種類（551H與552H），并進行7×2（發(fā)酵時間）、4×2（固態(tài)培養(yǎng)基組成）、5×2（發(fā)酵溫度）及5×2（接種量）試驗設計，每組試驗均重復3次。

1.5.2 優(yōu)化試驗設計-響應面設計

在研究各種工藝參數(shù)影響的基礎上，根據(jù)實際應用及統(tǒng)計分析確定每個因素的最高與最低水平，進行4因素的響應面設計，共27組，每組試驗均重復3次。試驗結果進行二次響應面回歸建模，并預測最佳工藝參數(shù)。

1.5.3 驗證試驗

在優(yōu)化試驗確定最佳理論工藝參數(shù)的基礎上，并對該工藝參數(shù)進行相應的發(fā)酵試驗，其結果與理論值進行比較，最終確定最佳工藝參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計方法

利用SAS 9.0軟件對試驗結果進行多因素方差分析（ANOVA）、最小二乘法（LSD）進行各水平之間的多重比較以及二次響應面回歸分析。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響

本研究所選用的是兩種市售仔豬配合飼料，具有較好的代表性，從表1可看出，551H與552H營養(yǎng)及配比各有側重，前者易消化吸收更適合斷奶的仔豬，后者利于腸道健康則更適合年齡更大的仔豬。對此我們分別對兩種配合飼料進行酵母固態(tài)發(fā)酵研究。通過發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)品的影響可以發(fā)現(xiàn)（圖1），在0～24 h內，兩種配合飼料均隨著發(fā)酵時間的延長其蛋白含量及其增加率相應提高，趨勢基本一致；但是，發(fā)酵時間達到24 h后，兩種飼料的蛋白所受的影響不同，551H呈“U”形態(tài)勢，而552H則呈“倒U”形態(tài)勢，具體來說，24～40～48 h，551H 先降后增趨勢，而552H 則與之相反。而通過統(tǒng)計學分析本次試驗結果，發(fā)酵時間影響著酵母對于這兩種飼料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P＜0.000 1），各水平的多重比較排序為：0 hd、12 hc、16 hbc、24 hab、32 hb、40 hb、48 ha（右上角不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中發(fā)酵12 h后產(chǎn)品中蛋白含量及其增加率顯著高于未發(fā)酵的產(chǎn)品（P＜0.05），但是12～16 h及16～40 h各水平之間的差異并不顯著（P＞0.05），發(fā)酵24 h及48 h產(chǎn)品中蛋白指標均有一個明顯的提升（P＜0.05）。因此，結合試驗結果與應用，在后續(xù)優(yōu)化試驗中對于551H，可確定發(fā)酵時間的最高水平（24 h）及最低水平（12 h），而對于552H，可確定發(fā)酵時間的最高水平（40 h）及最低水平（12 h）。至于發(fā)酵原料影響，主要體現(xiàn)在對產(chǎn)品蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P＜0.000 1)的影響非常顯著，且發(fā)酵551H 后蛋白的含量及其增加率明顯高于552H（P＜0.05）。

圖1 發(fā)酵時間對酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

酵母作為一種兼氧型微生物，在有氧或無氧的條件下均能生長，只是在有氧的條件下生長速度較快。對于本研究，固態(tài)發(fā)酵前期，由于顆粒間隙的存在，氧分充足，此時酵母好氧發(fā)酵占主導，隨著發(fā)酵的進行，氧分的逐步消耗，固態(tài)顆粒間傳質的不連續(xù)性，形成局部“無氧”，好氧發(fā)酵逐漸受到限制，厭氧發(fā)酵逐步上升。由于前期好氧發(fā)酵所代謝的產(chǎn)物及大量微生物的生成與凋亡，必將成為厭氧發(fā)酵首選營養(yǎng)物質而被利用（類似于過度發(fā)酵），因此，產(chǎn)品中營養(yǎng)指標蛋白含量出現(xiàn)下降，再延長發(fā)酵時間，厭氧發(fā)酵進程逐步加快，飼料中的營養(yǎng)成分開始成為酵母的主要營養(yǎng)物質來源，產(chǎn)品中蛋白含量出現(xiàn)回升。對于不同品種的仔豬配合飼料，好氧與厭氧發(fā)酵的轉化時間點是不一樣的，551H營養(yǎng)組成更利于酵母生長，發(fā)酵速度更快，再加上顆粒間隙小、容氧少，導致氧分快速耗盡，較552H先進入?yún)捬醢l(fā)酵，48 h時，厭氧發(fā)酵已進行快速生長期，而552H發(fā)酵到48 h時，才進入?yún)捬醢l(fā)酵期，因此，在所研究的48 h內，酵母固態(tài)發(fā)酵551H，好氧與厭氧發(fā)酵均能有效地進行，而對于552H，只能有效地進行好氧發(fā)酵，這樣就導致在產(chǎn)品的蛋白指標上，551H 優(yōu)于552H。當然，考慮到時間長不利于實際應用成本，兩種飼料在時間上盡量控制在好氧階段。

2.2 固態(tài)培養(yǎng)基組成對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響

研究中所采用的固態(tài)培養(yǎng)基由仔豬配合飼料與水組成，那么其中的固液比影響發(fā)酵的進程及相應的生產(chǎn)效率與成本。如圖2 所示，兩種培養(yǎng)基中，固液比的大小，影響著發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量及其增加率，但結果二者不同。對于551H 固態(tài)培養(yǎng)基，固液比的增加對于發(fā)酵的影響呈“N”形逐步向上態(tài)勢；而對于552H培養(yǎng)基，呈現(xiàn)出“倒L”形快速上升后趨緩態(tài)勢的特點?？偟膩碚f，低固液比（如50∶50）可獲得較高的產(chǎn)品品質，而高固液比（如80∶20）則不利于發(fā)酵的進行。但是，本次研究中，固態(tài)培養(yǎng)基組成對于發(fā)酵的產(chǎn)品蛋白含量的影響（P=0.004 3＜0.01）及蛋白增加率的影響（P＜0.000 1）的影響非常顯著，各水平的多重比較排序：（80∶20）b，（70∶30）a，（60∶40）a，（50∶50）a（右上角不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中高固液比（80∶20）對于發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量及其增加率顯著低于其它水平發(fā)酵的產(chǎn)品（P＜0.05），但是對于另外三水平之間的水平差異并不顯著（P＞0.05），因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結合生產(chǎn)實際，確定固液比最高水平（80∶20=4）及最低水平（60∶40=1.5）。另外，培養(yǎng)基的種類對蛋白含量（P＜0.000 1）有顯著影響，而且發(fā)酵551H后蛋白的含量明顯高于552H（P＜0.05）。

圖2 固態(tài)培養(yǎng)基組成對酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

酵母必須有水才能存活，但酵母需要的水分比細菌少，對滲透壓有相當高的耐受性。固態(tài)培養(yǎng)基中水分的含量影響著各種微生物養(yǎng)分的溶解，從而影響著滲透壓。對于551H，含有大量可溶解的營養(yǎng)成分（表1），水分含量的增加，易溶營養(yǎng)成分增加，滲透壓加大，有利于酵母的吸收利用，因此低固液比（50∶50）有利于該菌種的生長。對于552H，易溶營養(yǎng)組分較少，較高水分含量下，滲透壓基本上變化不大，因此固液比低于（80∶20）下產(chǎn)品蛋白指標變化不大。由上分析可知，兩種培養(yǎng)基的組成決定了酵母固態(tài)發(fā)酵551H 優(yōu)于552H?？偟膩碚f，鑒于實際應用及試驗結果，固液比可控制在（60∶40）之上。

2.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響

酵母細胞最適生長溫度一般在20～30 ℃，不能高于47 ℃。圖3表現(xiàn)了兩種飼料在不同發(fā)酵溫度下其發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白的變化，而且對不同飼料，其變化趨勢不同。對于551H，32 ℃較有利于酵母的生長，過高或過低均不利于該菌種生長；而對于552H，28 ℃時發(fā)酵產(chǎn)品有較高的蛋白及其增長率。而對所獲得的結果進行統(tǒng)計分析，溫度對該發(fā)酵產(chǎn)品蛋白含量（P=0.041 1＜0.05）及其增加率（P=0.022 6＜0.05)均影響顯著，各水平的多重比較排序為：25 ℃abc、28 ℃ab、30 ℃a、32 ℃bc、35 ℃c（右上角不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，25～30 ℃之間差異不明顯，且有利于酵母的生長。因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結合生產(chǎn)實際，對于551H，確定最高發(fā)酵溫度32 ℃及最低發(fā)酵溫度25 ℃；而對于552H，確定最高發(fā)酵溫度30 ℃及最低發(fā)酵溫度25 ℃。至于發(fā)酵基的種類，在本次試驗中發(fā)現(xiàn)其對于產(chǎn)品蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P=0.004 1＜0.01)的影響非常顯著，具體表現(xiàn)在551H發(fā)酵后所得產(chǎn)品的蛋白含量明顯高于552H（P＜0.05），但蛋白增加率與之相反。

溫度改變，影響微生物的代謝活動，從而影響微生物的生命活動。溫度的提高，均有利于酵母對于這兩種飼料的發(fā)酵，只是影響程度各不相同。前已分析，對于相同溫度與相同發(fā)酵時間內，551H 較552H有更高的發(fā)酵速度，導致25～28 ℃升溫過程中對于產(chǎn)品蛋白的影響不顯著，而552H則影響明顯；進一步提高溫度，對于551H，酵母生長加速明顯，可利用營養(yǎng)物質充分，產(chǎn)品中蛋白含量增加，到32 ℃，由于酵母的快速生長導致營養(yǎng)快速消耗改變了環(huán)境因子，從而抑制發(fā)酵進行，不利于產(chǎn)品蛋白指標；至于552H，由于組成與551H 的差異，高于28 ℃，在研究的發(fā)酵時間內，營養(yǎng)快速消耗致使過早地抑制發(fā)酵的進程。

2.4 接種量對發(fā)酵產(chǎn)品蛋白的影響

圖3 發(fā)酵溫度對酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

圖4 接種量對酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

如圖4所示，接種量對于酵母固態(tài)發(fā)酵這兩種仔豬配合飼料的影響趨勢基本一致。試驗發(fā)現(xiàn)，較低的接種量（3%～5%）更利于酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬飼料，而增加接種量，551H 發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量及增加率趨于“V”形態(tài)，即下降后有所增加，而對于552H，增加接種量后基本趨于穩(wěn)定。統(tǒng)計分析結果表明，接種對發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量（P=0.004 0＜0.01）及其增加率（P=0.002 5＜0.01）的影響非常顯著，各水平的多重比較排序：3%a、5%b、10%a、15%a、20%a（右上角不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，接種量3%對于發(fā)酵產(chǎn)品中蛋白含量及其增加率顯著高于接種量5%所發(fā)酵的產(chǎn)品（P＜0.05），而與其它水平之間的差異并不顯著。因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結合生產(chǎn)實際，確定接種量最高水平為10%，最低水平為3%。另外，本次試驗中固態(tài)培養(yǎng)基對于產(chǎn)品中蛋白含量（P＜0.000 1）及其增加率（P=0.001 0＜0.01）影響非常顯著，而且551H發(fā)酵后所得產(chǎn)品的蛋白含量明顯高于552H（P＜0.05），但是552H發(fā)酵后所得產(chǎn)品的蛋白增加率明顯高于551H（P＜0.05）。

本次試驗結果表明，較低的接種量（3%～5%）的情況下，有利于酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料，均能獲得較好的發(fā)酵效果。由于種子培養(yǎng)液中菌體濃度均達到較高的水平（＞108CPL/ml），以較低接種量接種后應具有較高的分布密度，利于酵母的快速生長。當接種量增加到15%時，高密度的菌種將會過快地消耗飼料中有限的養(yǎng)分，微生物競爭性生長加劇，相同時間內過早地抑制發(fā)酵的進程，而厭氧發(fā)酵沒有起到主導作用。對于551H，當接種量達到20%時，會出現(xiàn)產(chǎn)品的蛋白指標有所提升，這應該是后期酵母厭氧發(fā)酵起到了主導作用。由于551H 與552H 微生物可利用養(yǎng)分及顆粒間透氣性的差異，導致了發(fā)酵產(chǎn)品中出現(xiàn)了552H發(fā)酵產(chǎn)品具有較高的蛋白增加率，當然，具體機制仍需要進一步研究。

2.5 響應面試驗設計與結果

2.5.1 固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H

在前期確定各種因素的最高與最低水平(發(fā)酵時間12～24 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5～4，發(fā)酵溫度25～32 ℃，接種量3%～15%)下，進行如表2 所示的響應面試驗。通過對該試驗結果統(tǒng)計分析（表3）發(fā)現(xiàn)，在所構造的二次模型中，一次項t、R、T、I 及二次項T×T、t×t、R×R及模型整體均較為顯著（P＜0.01），且模型的失擬項（P＞0.05）不顯著，該模型可在各因素的水平范圍內應用于酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H 工藝。通過擬合并估計出二次響應面回歸模型各顯著項的系數(shù)，并進行蛋白含量及增加率最高時的最佳工藝參數(shù)預測，其結果為：發(fā)酵時間24 h、固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值2.75、發(fā)酵溫度32 ℃、接種量3%，此時有較高的蛋白含量（22.79%）及其增加率（8.78%）。

表2 酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H響應面設計與結果

表3 酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H優(yōu)化試驗統(tǒng)計分析結果

2.5.2 固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H

在前期確定各種因素的最高與最低水平(發(fā)酵時間12～40 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5～4，發(fā)酵溫度25～30 ℃，接種量3%～15%)下，進行如表4 所示的響應面試驗。通過對該試驗結果統(tǒng)計分析（表5）發(fā)現(xiàn)，在所構造的二次模型中，一次項t、R、T、I及二次項t×t、T×T、R×R 及模型整體均較為顯著（P＜0.01），且模型的失擬項（P＞0.05）不顯著，該模型可在各因素的水平范圍內應用于酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H工藝。通過擬合并估計出二次響應面回歸模型各顯著項的系數(shù)，并進行蛋白含量及增加率最高時的最佳工藝參數(shù)預測，其結果為：發(fā)酵時間40 h、固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值2.125、發(fā)酵溫度27.5 ℃、接種量3%，此時有較高的蛋白含量（21.40%）及其增加率（11.05%）。

表4 酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H響應面設計與結果

表5 酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H優(yōu)化試驗統(tǒng)計分析結果

表6 驗證試驗及統(tǒng)計分析結果

2.5.3 驗證試驗

為了進一步檢驗經(jīng)過響應面設計試驗所獲得的模型及其預測的最佳工藝條件的可靠性，在最佳工藝條件進行驗證試驗，并重復5 次，結果及統(tǒng)計分析如表6所示：對于酵母固態(tài)發(fā)酵551H及552H，驗證試驗結果與預測結果差異性均不顯著（P＞0.05）,因此，模型預測的最佳工藝參數(shù)適合實際應用。

3 結論

對于酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H 及552H的發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值、發(fā)酵溫度、接種量等工藝參數(shù)進行了系統(tǒng)地研究，得到如下結論：

①在前期各因素對于固態(tài)發(fā)酵的影響試驗中，發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成、發(fā)酵溫度、接種量以及固態(tài)培養(yǎng)基的種類顯著影響著酵母對于這兩種飼料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白含量及其增加率。

②對于固態(tài)發(fā)酵551H，確定各種因素的最高與最低水平為發(fā)酵時間12～24 h、固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5～4、發(fā)酵溫度25～32 ℃、接種量3%～15%；對于固態(tài)發(fā)酵552H，確定各種因素的最高與最低水平為發(fā)酵時間12～40 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1.5～4，發(fā)酵溫度25～30 ℃，接種量3%～15%。

③通過響應面試驗設計統(tǒng)計分析得到可靠性較高的二次響應面回歸模型，并預測最佳工藝參數(shù)：對于固態(tài)發(fā)酵551H，發(fā)酵時間24 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值2.75，發(fā)酵溫度32 ℃，接種量3%；對于固態(tài)發(fā)酵552H，發(fā)酵時間40 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值2.125，發(fā)酵溫度27.5 ℃，接種量3%，驗證試驗證明該參數(shù)可行。

因此，該研究結果將為工業(yè)化酵母固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的工藝提供試驗與理論支撐，但是仍需要進行放大試驗、中試等進一步研究，以更好地應用實際生產(chǎn)。