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        產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌發(fā)酵條件的響應面優(yōu)化

        2019-01-02 12:44:24盧軼男張佑紅
        武漢工程大學學報 2018年6期
        關鍵詞:谷氨酸鈉氮源碳源

        田 莉,盧軼男,朱 建,張佑紅

        武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院,湖北 武漢 430205

        血栓相關的心血管疾病嚴重威脅著人類的健康,世界上每年都有1 700萬人死于這些疾病。不溶性纖維蛋白的堆積是形成血栓的主要原因,且會進一步導致各種心血管疾病的并發(fā)癥,因此預防和治療心血管疾病的關鍵是降解不溶性纖維蛋白。目前治療心血管疾病的臨床藥物主要有尿激酶、鏈激酶、纖溶酶原激活劑等[1]。納豆激酶(nat?tokiase,NK)來源于日本的傳統(tǒng)食物納豆,是一種絲氨酸蛋白酶,對溶解纖維蛋白有顯著的作用,相比其他治療血栓的臨床藥物,NK具有半衰期長,無副作用,價格低廉的優(yōu)點[2]。

        NK在pH 6-12表現(xiàn)出高活性且穩(wěn)定,不僅可以直接溶解纖維蛋白,而且可以促進細胞釋放組織型纖溶酶原激活劑;NK還能催化尿激酶原從肝臟釋放,從而激活循環(huán)中的纖溶酶原[3];此外NK還可以降低血漿中的纖維蛋白原、凝血因子VII和凝血因子VIII[4-5]。NK作為潛在的新一代治療心血管疾病的臨床藥物,具有安全、高效、經(jīng)濟等特點[6-7],另外NK保健品也相繼出現(xiàn)在國內市場,NK未來的應用前景十分廣闊。

        目前,NK多通過從納豆食品中篩選出的納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)[8-9]。野生菌株合成NK的途徑復雜,且雜蛋白較多,導致后期分離純化的過程復雜,較難分離出高純度成品[10]。本實驗室前期構建了一株能夠高效表達NK的以枯草芽孢桿菌WB800N為宿主細胞的基因工程菌株。本研究以該菌株為出發(fā)菌株,利用響應面Box-Behnken模型對液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化,提高納豆激酶的酶活力。

        1 實驗部分

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌工程菌(PHT43-WB800N)為本實驗室構建保藏菌株,可重組高效表達NK酶。

        1.1.2 主要試劑 尿激酶(1 240 IU/支,北京中科質檢生物技術有限公司);纖維蛋白原和凝血酶(上海源葉生物科技有限公司);IPTG來源于Bio Basic Inc;胰蛋白胨粉和酵母提取物粉(英國Oxoid公司);氯霉素(上海生工生物工程有限公司);大豆蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、淀粉、纖維素、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3等(國藥集團化學試劑有限公司)。

        1.1.3 培養(yǎng)基

        LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂粉3%、pH 7.2~7.4。

        種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、pH 7.2~7.4。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、K2HPO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO40.5 g/L、CaCl20.5 g/L、NaCl 10 g/L、谷氨酸鈉10 g/L、檸檬酸鈉 20 g/L、pH 7.2~7.4。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 種子培養(yǎng) 用接種環(huán)取少量甘油菌株至LB(含Cm5抗生素)平板上劃線,37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含Cm5抗生素),37℃,200 r/min,搖瓶培養(yǎng)12 h,活化菌種。按2%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基(含Cm5抗生素),37℃,200 r/min,搖瓶培養(yǎng)8 h,即為發(fā)酵種子液。

        1.2.2 發(fā)酵條件 取2%接種量的種子液接種至250 mL錐形瓶(內含50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基且含有Cm5抗生素)中,37℃,200 r/min,搖瓶培養(yǎng)至OD值達到0.6時,加入1 mmol/L IPTG誘導劑誘導表達6 h。

        1.2.3 單因素實驗 在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上,通過單因素實驗來考察碳源、氮源種類和質量濃度、谷氨酸鈉質量濃度、檸檬酸鈉質量濃度、金屬鹽離子質量濃度、接種量和pH等因素對NK酶活力的影響。其中碳源:葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、甘油、乳糖、纖維素、可溶性淀粉,質量濃度均為20 g/L;氮源:大豆蛋白胨,蛋白胨,胰蛋白胨,酵母粉,NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3,質量濃度均為20 g/L。氮源、碳源、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NaCl濃度梯度設為 0 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L;MgSO4、CaCl2、K2HPO4、KH2PO4質量濃度梯度設為 0 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L。接種量分別為:1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%;pH分別取值:5、6、7、8、9、10。

        1.2.4 Box-Behnken實驗設計和響應面分析 在單因素實驗的基礎上,利用軟件Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken模塊對發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、MgSO4、CaCl2和pH五因素三水平進行實驗設計安排,并對實驗結果進行響應面分析,從而確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

        1.2.5 酶活檢測 本研究采用纖維蛋白平板法檢測NK酶活性[11],實驗中所需要的尿激酶溶液、凝血酶溶液、瓊脂糖溶液和纖維蛋白原溶液均為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)配制。向50 mL錐形瓶中加入5 mL瓊脂糖溶液(10 g/L)、5 mL纖維蛋白原溶液(2.2 g/L)和100 μL(10 IU)凝血酶,混勻,及時倒入潔凈干燥的培養(yǎng)皿中,室溫放置1 h,待纖維蛋白凝塊形成后打孔備用。稀釋8個不同濃度的尿激酶標準品溶液,繪制納豆激酶標準曲線,其具體實驗操作見參考文獻[12]。取1 mL發(fā)酵液,8 000 r/min,離心2 min,向纖維蛋白平板中加入4 μL上清液,37℃,孵育18 h,測量溶纖透明圈的直徑,根據(jù)透明圈面積,在標準曲線上得到對應的NK酶的酶活力大小。

        2 結果與討論

        2.1 尿激酶標準曲線

        由圖1可知,NK標準曲線線性關系為Y=2.373 55X-107.619 52,R2=0.998。根據(jù)測量纖維平板上透明圈的直徑,計算出透明圈面積,再利用NK標準曲線線性關系,則可以計算出發(fā)酵液纖溶酶活力。

        圖1 NK標準曲線Fig.1 Nattokinase standard curve

        2.2 單因素實驗結果

        2.2.1 不同碳源和氮源對NK酶活性的影響 如圖2(a)所示,有機氮源與無機氮源相比,有機氮源能明顯提高NK酶活力。其中以蛋白胨為氮源時,NK酶活力最高達到1 340.92 IU/mL;其次是以酵母粉為氮源時,NK酶活達到1 175.43 IU/mL;無機氮源(NH4)2SO4相比其他無機氮源表現(xiàn)出較高酶活;這是因為NK酶是一種絲氨酸蛋白酶,其酶活可能需要蛋白質或蛋白質水解產(chǎn)物的參與[13]。因此選蛋白胨為該工程菌株的最佳氮源,這與之前的文獻報道一致[14]。由圖 2(b)可知,不同碳源表現(xiàn)出的酶活差別不大,其中以葡萄糖為碳源時,NK酶活最高達到1 330.29 IU/mL;其次是以可溶性淀粉為碳源時,其NK酶活為1 157.75 IU/mL;乳糖被吸收利用的效果低于其他碳源。因此選葡萄糖是該菌株的最佳碳源,此前也有相同報道[15-17]。

        2.2.2 不同濃度碳源和氮源濃度對NK酶活的影響 有文獻[18]報道,谷氨酸鈉是NK酶表達的顯著影響因子,谷氨酸鈉能夠促進NK酶活力;檸檬酸鈉是三羧酸循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物,能促進谷氨酸的合成,從而能提高NK酶的活力。因此本實驗研究了不同質量濃度谷氨酸鈉和檸檬酸鈉對NK酶活的影響。圖3(a)顯示,不同質量濃度的谷氨酸鈉和檸檬酸鈉對NK酶活性影響不大,這說明不同菌株間的合成調控機制不一樣,對酶活影響的因素有差異。當不添加蛋白胨時,NK酶活力極低;隨著蛋白胨質量濃度的增加,NK酶活力逐漸增加,當?shù)鞍纂速|量濃度為20 g/L時,NK酶活達到最大值1 320.64 IU/mL;當?shù)鞍踪|量濃度大于40 g/L時,NK酶活明顯下降;因此初步選擇蛋白胨適宜質量濃度為20 g/L。不添加葡萄糖時,NK有少量活性,此時谷氨酸鈉和檸檬酸鈉可以充當碳源;當葡萄糖質量濃度為20 g/L時,NK酶活性達到最大值;因此葡萄糖質量濃度為20 g/L是最佳碳源濃度。

        圖2 對NK酶活性的影響:(a)氮源,(b)碳源Fig.2 Effects on nattokinase activity:(a)nitrogen source,(b)carbon source

        2.2.3 不同金屬鹽離子濃度對NK酶活性的影響如圖3(b)所示,當 NaCl質量濃度為 10 g/L時,NK表現(xiàn)出最高活性;隨著NaCl質量濃度的增加,NK酶活呈下降趨勢;當NaCl質量濃度接近40 g/L時,NK酶活下降顯著;因此最佳NaCl質量濃度為10 g/L。不同質量濃度K2HPO4和KH2PO4對NK酶活性影響不大,MgSO4和CaCl2對NK酶活性影響顯著。當MgSO4質量濃度由0 g/L增加至1 g/L時,NK酶活呈明顯上升趨勢,隨著MgSO4質量濃度繼續(xù)增加時,NK酶活開始逐漸下降;當CaCl2質量濃度由0 g/L~0.5 g/L時,NK酶活呈明顯上升趨勢,隨著CaCl2質量濃度繼續(xù)增加時,NK酶活開始呈下降趨勢;因此最佳MgSO4質量濃度為1 g/L,最佳CaCl2質量濃度為0.5 g/L。

        2.2.4 不同pH和接種量對NK酶活的影響 如圖4(a)所示,pH值對NK酶活影響略大,當pH值為6~9時,NK表現(xiàn)出高活性,差異不明顯;其中當pH為7.0時,NK酶活性相對較高;在強酸性條件,NK酶表現(xiàn)出低活性,這是因為在酸性條件下,納豆激酶缺乏功能和結構的穩(wěn)定性[19]。圖 4(b)中,接種量對NK酶活性影響不明顯,當接種量為3%時,NK酶活力略高。

        圖3 對NK酶活的影響:(a)碳源和氮源質量濃度,(b)金屬鹽離子質量濃度Fig.3 Effects on nattokinase activity :(a)carbon and nitrogen source mass concentration ,(b)ion salts mass concentration

        圖4 (a)不同pH值和(b)接種量對NK酶活的影響Fig.4 Effect of(a)pH and(b)inoculation amount on nattokinase activity

        2.3 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件結果分析

        2.3.1 響應面實驗因素水平設計 以蛋白胨(A)、葡萄糖(B)、MgSO4(C)、CaCl2(D)、pH(E)為自變量,以透明圈直徑為響應面值,進行五因素三水平響應面實驗,實驗因素水平見表1,五因素三水平響應面實驗設計及實驗結果見表2。

        表1 響應面因素水平表Tab.1 Factors and levels in response surface analysis

        2.3.2 模型建立及顯著性分析 利用軟件Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken模塊對表2進行多元回歸擬合分析,得到透明圈直徑(Y)二次多元回歸模型方程:

        Y=26.21+3.34A+2B+4.25C-0.590+

        0.94E-0.62AB+1.11AC-0.13AD-0.56AE+

        0.89BC+0.45BD+2.36BE+0.68CD+0.48CE+

        1.36DE-2.21A2-2.63B2-2.85C2-1.89D2-0.91E2

        回歸方程決定系數(shù)R2=0.914 7,信噪比RSN=13.754。由表3可知,模型F值為13.41,P< 0.000 1,顯著性顯示為極為顯著,表明回歸方程的擬合度和可信度較高,可用此模型對實驗結果進行分析。

        由表3可知,蛋白胨(A)、葡萄糖(B)和MgSO4(C)方差分析表中P<0.000 1,說明A,B,C對NK酶活影響是極為顯著的;交叉項BE對酶活的影響顯著;其他交叉項對酶活影響不顯著;平方項A2,B2,C2,D2對酶活影響極為顯著。

        表2 Box-Behnken試驗設計及結果Tab.2 Design and results of Box-Behnken experiments

        表3 響應面二次回歸方程模型方差分析結果Tab.3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model Analysis of variance table

        2.3.3 響應面分析 圖5為響應面分析曲面圖和等高線圖,反應了五因素之間的相互交叉作用對酶活的影響。根據(jù)模型求響應面的極值點,最佳發(fā)酵條件為:蛋白胨26.05 g/L,葡萄糖29.29 g/L,MgSO41.5 g/L,CaCl20.74 g/L,pH 9.0,NK 酶最高酶活為2 246.33 IU/mL。以最佳發(fā)酵條件進行實驗驗證,重復實驗3次,取NK酶活平均值為2 186.17 IU/mL,與預測值接近,表明該模型是可行的,具有一定的實踐價值。

        圖5 各因素間相互作用對納豆激酶酶活影響:(a)(b)蛋白胨質量濃度和葡萄糖質量濃度相互作用,(c)(d)蛋白胨質量濃度和MgSO4質量濃度相互作用,(e)(f)葡萄糖質量濃度和pH相互作用Fig.5 Response surface plots and contour line showing the interaction between each factor and nattokinase activity:(a)(b)effects of petone and glucose mass concentration interaction on nattokinase activity,(c)(d)effects of petone and MgSO4mass concentration interaction on nattokinase activity,(e)(f)effects of glucose mass concentration and pH interaction on nattokinase activity

        3 結 語

        本次研究對影響枯草芽孢桿菌基因工程菌株產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)進行了初步探討。通過單因素實驗和響應面Box-Behnken模型優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù),其中有機氮源的利用率明顯高于無機氮源,這可能是因為NK酶活需要蛋白質或蛋白質水解產(chǎn)物的參與;不同碳源對酶活影響不大,從經(jīng)濟角度來考慮可以選擇可溶性淀粉作為碳源;金屬離子K+和PO43-對NK活性影響不明顯,而Mg2+和Ca2+對NK活性影響顯著;該菌株在pH 6~9的環(huán)境下,生長狀態(tài)良好且產(chǎn)物NK表現(xiàn)出高酶活。本次研究獲得了NK最優(yōu)液體發(fā)酵條件:蛋白胨 26.05 g/L,葡萄糖 29.29 g/L,MgSO41.5 g/L,CaCl20.74 g/L,NaCl 10 g/L,pH 9.0,接種量3%。在最佳發(fā)酵條件下,IPTG誘導發(fā)酵6 h,NK獲得最高酶活為2 186.17 IU/mL,比優(yōu)化前提高了269%。基因工程菌比野生菌株發(fā)酵產(chǎn)物NK表現(xiàn)出更高活性,且發(fā)酵產(chǎn)物雜蛋白少,為高純度的NK的高產(chǎn)化奠定了一定的基礎,為未來制備預防、治療血栓等心血管疾病臨床藥物的開發(fā)提供了新思路[20]。

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