劉 丹，徐澤彬，王 凱*，2，汪澤江，吳風(fēng)收

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062

卟啉及卟啉衍生物作為一種大分子雜環(huán)化合物廣泛存在于自然界中，在不同領(lǐng)域如高分子材料，化學(xué)催化，靶向藥物治療等都有著重要的應(yīng)用，并在生命活動(dòng)中扮演著重要的角色。在光動(dòng)力治療過(guò)程中，卟啉扮演著十分重要的角色。卟啉作為光敏劑，受到一定波長(zhǎng)的光照射后由單線態(tài)基態(tài)激發(fā)到更高能量的單線態(tài)激發(fā)態(tài)產(chǎn)生1O2，或者電子和氫的轉(zhuǎn)移到底物分子上成為活性自由基在細(xì)胞組織內(nèi)擴(kuò)散，進(jìn)而破壞組織引起細(xì)胞凋亡，對(duì)整個(gè)細(xì)胞造成損傷進(jìn)行光動(dòng)力治療［1-3］。

大部分卟啉化合物主要是以DNA-卟啉復(fù)合物的方式與DNA可逆的結(jié)合，卟啉與DNA的相互作用模式是新型藥物分子設(shè)計(jì)、篩選和臨床研究的基礎(chǔ)，所以在生物活性研究方面十分重要［4-5］?？梢酝ㄟ^(guò)紫外吸收光譜，熒光發(fā)射光譜以及圓二色光譜研究卟啉化合物與DNA的相互作用模式，目前提出了3種主要的相互作用方式［6］：a）嵌插結(jié)合；b）外部結(jié)合；c）外部堆積。隨著DNA加入卟啉溶液后，卟啉的soret帶出現(xiàn)較大程度的減色（＞30%）和一定程度的紅移（＞5 nm），熒光光譜出現(xiàn)明顯的變化，產(chǎn)生負(fù)的圓二色譜信號(hào)說(shuō)明卟啉與DNA之間為插入模式；如果紫外吸收光譜變化很小，沒(méi)有明顯的減色和紅移，熒光強(qiáng)度變化不明顯，產(chǎn)生正的圓二色譜信號(hào)說(shuō)明卟啉與DNA之間為外部結(jié)合模式；當(dāng)吸收光譜與嵌插作用相似時(shí)，熒光強(qiáng)度變化不明顯，圓二色譜有等強(qiáng)度的正、負(fù)信號(hào)，說(shuō)明卟啉與DNA發(fā)生外部堆積。

光動(dòng)力治療過(guò)程中，光的穿透性對(duì)光敏劑殺死腫瘤細(xì)胞有很大影響。通常光的滲透性與波長(zhǎng)和組織深度及其光學(xué)特性有很大關(guān)系。成年人體內(nèi)水分占體重的60%～70%，波長(zhǎng)小于700 nm的光能夠被水分子散射而且會(huì)被內(nèi)源發(fā)色團(tuán)如血紅蛋白吸收，波長(zhǎng)大于900 nm的光可以被水分子吸收［7-8］，所以理想藥物在 700 nm～950 nm的近紅外區(qū)域被激活治療效果會(huì)更顯著［9-10］。光動(dòng)力治療藥物的理想激發(fā)波長(zhǎng)能夠有更強(qiáng)的組織穿透性和更少的水分子吸收干擾，而卟啉化合物的soret帶在400 nm～500 nm范圍內(nèi)有強(qiáng)吸收，所以其雙光子吸收（2-PA）范圍應(yīng)該在800 nm～1 000 nm內(nèi)。卟啉化合物長(zhǎng)波長(zhǎng)的吸收，高的單線態(tài)氧產(chǎn)率及良好的DNA結(jié)合能力，使得其在雙光子光動(dòng)力治療（2PA-PDT）中有很大的優(yōu)勢(shì)［11］。因此，本課題組先前設(shè)計(jì)并合成了N，N-偶聯(lián)共軛雙卟啉化合物（Por 1）及其Zn配合物（Por 2），以及為了改善雙卟啉水溶性，進(jìn)一步制備了N，N-偶聯(lián)甲基吡啶雙卟啉化合物（Por 3），如圖1所示。為了進(jìn)一步研究這些親油性和親水性雙卟啉化合物與DNA結(jié)合模式的不同，采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜、熒光發(fā)射光譜以及圓二色譜等光學(xué)研究手段來(lái)檢測(cè)目標(biāo)化合物與DNA之間的相互作用，希望為后期體外細(xì)胞活性研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

圖1 卟啉化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of porphyrins

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Cary UV-100紫外-可見(jiàn)光譜儀；PTI QM-4/2005熒光光譜儀；JASCO J-720圓二光色譜儀；pHS-828 pH計(jì)（合肥卓爾儀器儀表有限公司）。

三種卟啉化合物參照先前合成的方法制備［12］。小牛胸腺DNA（ct-DNA）（Sigma-Aldrich公司），根據(jù)吸光光譜來(lái)測(cè)定其濃度，又ε260=6 600 L·mol-1·cm-1，通過(guò)公式計(jì)算得ct-DNA濃度為4.74×10-4mol/L。水為純化水，試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

測(cè)定環(huán)境為大氣壓和（20±2）℃。紫外-可見(jiàn)吸收光譜，熒光發(fā)射光譜，圓二色譜的測(cè)試均在濃度 為 0.05 mol/L Tris-HCl和 0.1 mol/L NaCl（pH=7.4）的緩沖溶液中進(jìn)行。

1.2 光譜測(cè)試

1.2.1 紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)試 在3 mL樣品池中加入27 μL 1 mmol/L卟啉儲(chǔ)備液和3 mL Tris-HCl緩沖溶液，稀釋卟啉溶液至濃度為9μmol/L。在350nm～500 nm范圍內(nèi)測(cè)定其紫外吸收后，以ct-DNA滴定卟啉溶液，每次滴定后充分混合5 min，再測(cè)定此混合溶液的紫外吸收光譜，樣品池厚度為1 cm。

1.2.2 熒光光譜測(cè)試 在3mL樣品池中加入27μL 1 mmol/L卟啉儲(chǔ)備液和3 mL Tris-HCl緩沖溶液，稀釋卟啉溶液至濃度為9 μmol/L。則在600 nm～800 nm范圍內(nèi)測(cè)定熒光發(fā)射光譜后，以ct-DNA滴定卟啉溶液，每次滴定后充分混合5 min，再測(cè)定此混合溶液的熒光發(fā)射光譜，樣品池厚度為1 cm。卟啉 1、2、3的激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為 427 nm，419 nm，424 nm。激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫設(shè)置為10 nm。

1.2.3 圓二光色譜測(cè)試 取卟啉儲(chǔ)備液于ct-DNA溶液中混合，定容稀釋至濃度為18 μmol/L，加入樣品池中。r=n（Porphyrin）∶n（DNA），r=0.05。在400 nm～500 nm范圍內(nèi)測(cè)量，CD光譜帶寬度為1 nm，靈敏度為10 mdeg，分辨率為0.1 nm，掃描速度為100 nm/min，樣品池為1 cm，掃描空白緩沖液用于校正基線。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)試

在紫外-可見(jiàn)吸收光譜中，采用不同濃度ct-DNA與卟啉化合物結(jié)合觀察吸收峰的變化，濃度范圍分別為0 μmol/L、0.79 μmol/L、1.57 μmol/L、3.14μmol/L、6.24μmol/L、9.29μmol/L、12.31μmol/L、18.23 μmol/L、24.00 μmol/L、29.63 μmol/L、35.11 μmol/L、40.46 μmol/L、50.79 μmol/L、60.63 μmol/L、79.00 μmol/L、99.79 μmol/L。觀察卟啉Soret帶吸光度以及最大吸收波長(zhǎng)的變化，由表1和圖2可知，所有卟啉樣品的Soret帶的吸光度出現(xiàn)了一定程度的減色并伴隨著紅移。這是由于卟啉大環(huán)結(jié)構(gòu)中π*的共軛體系能夠與DNA堿基共軛體系中的π發(fā)生電子堆積，引起電荷的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致能級(jí)降低，從而致使π→π*躍遷能級(jí)變小產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。同時(shí)電子轉(zhuǎn)移后的π軌道因?yàn)椴糠殖錆M電子，減小了π→π*躍遷的幾率，產(chǎn)生減色效應(yīng)［13］。卟啉1有較大程度的減色（＞40%），沒(méi)有出現(xiàn)明顯的紅移（＜5 nm），初步推斷與DNA的相互作用模式為表面堆積的外部鍵合模式。卟啉2的減色程度為68%，并且有較為明顯的紅移現(xiàn)象（6nm），說(shuō)明卟啉2與DNA相互作用模式為插入和外部結(jié)合并存。卟啉3減色程度不明顯并且沒(méi)有出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，初步推斷卟啉3與DNA的相互作用模式為外部鍵合模式。

圖2 ct-DNA結(jié)合卟啉的紫外可見(jiàn)吸收光譜：（a）卟啉1，（b）卟啉2，（c）卟啉3Fig 2 UV-Vis absorption spectra of ct-DNA combined with porphyrin ：（a）Por 1，（b）Por 2，（c）Por 3

表1 Por1、Por2和Por3與ct-DNA的相互作用Tab.1 Interactions of Por1，Por2 and Por3 with ct-DNA

結(jié)合常數(shù)K可以表示卟啉與DNA的結(jié)合能力。根據(jù)文獻(xiàn)K值可由下列方程式計(jì)算得出［14］：

其中c代表DNA的濃度，單位為mol/L；△εap=|εA- εF|；△ε=|εB-εF|；εA=Aobs/［Porphyrin］；εB和 εF分別表示DNA-卟啉復(fù)合物的消光系數(shù)和未與DNA結(jié)合的自由卟啉的消光系數(shù)。c/△εap和c之間具有一定的線性關(guān)系可線性擬合得出方程。為確保DNA與卟啉作用充分，線性擬合的準(zhǔn)確性，通常從r=1.1開(kāi)始獲取數(shù)據(jù)。線性擬合得到直線后，將斜率1/△ε與截距1/（△εK）相除可計(jì)算得到K值（如表2）。當(dāng)結(jié)合常數(shù)K在106～107則說(shuō)明為插入模式，結(jié)合常數(shù)K在105左右則說(shuō)明為外部結(jié)合模式。

表2 卟啉1、2、3的結(jié)合常數(shù)Tab.2 Binding constants of Por1，Por2 and Por3

從表2中可以看出Por 3的結(jié)合常數(shù)最小，Por 1和Por 2與DNA的結(jié)合能力均強(qiáng)于Por 3，結(jié)合紫外吸收光譜表明與DNA為外部鍵合的結(jié)合模式。根據(jù)文獻(xiàn)可得EB與DNA的結(jié)合常數(shù)為5.54×105L/mol［6］，故比較表中數(shù)據(jù)可知 Por1、2、3與DNA的結(jié)合能力明顯強(qiáng)于EB。

2.2 熒光發(fā)射光譜

利用不同濃度的ct-DNA來(lái)滴定卟啉化合物，得到熒光發(fā)射光譜如圖3和表1所示，3個(gè)卟啉的熒光強(qiáng)度隨著ct-DNA濃度的增加都有不同程度的減弱，Por 1發(fā)生了一定程度的藍(lán)移，Por 2，Por 3都發(fā)生了一定程度的紅移。這是由于卟啉環(huán)與金屬Zn形成配位化合物，使得卟啉共軛體系中電子云密度降低或者與金屬本身的軸向配位有關(guān)。在低濃度ct-DNA下，Por 3熒光強(qiáng)度開(kāi)始降低，這是由于卟啉在DNA表面的自堆積。在高濃度ct-DNA下，熒光強(qiáng)度有很大程度的增強(qiáng)同時(shí)伴有明顯的紅移現(xiàn)象，并且在663 nm處卟啉發(fā)射峰的雙峰開(kāi)始裂縫明顯，出現(xiàn)了強(qiáng)的熒光發(fā)射，這是由于卟啉插入到DNA堿基對(duì)里，導(dǎo)致所處環(huán)境變?yōu)槭杷运?，進(jìn)而使得卟啉自堆積能力降低，Por 3從聚集體轉(zhuǎn)變?yōu)閱我粦B(tài)使得熒光強(qiáng)度增加［15］。結(jié)果表明，Por 3與DNA之間存在著多種結(jié)合模式，這種結(jié)合模式會(huì)因?yàn)閏t-DNA濃度的不同而發(fā)生變化。

圖3 ct-DNA結(jié)合卟啉的熒光發(fā)射光譜：（a）卟啉1，（b）卟啉2，（c）卟啉3Fig.3 Fluorescence emission spectra of ct-DNA combined with porphyrin：（a）Por 1，（b）Por 2，（c）Por 3

2.3 圓二光色譜

圓二色光譜是研究卟啉化合物與DNA結(jié)合模式最直接的方法之一。當(dāng)DNA與卟啉化合物相互作用后，在卟啉soret區(qū)域產(chǎn)生的信號(hào)可以判斷其結(jié)合模式。ICD信號(hào)為正，表明分子的長(zhǎng)軸與短鏈DNA的堿基對(duì)間處于平行的幾何位置，卟啉與DNA為外部小溝結(jié)合模式；ICD信號(hào)為負(fù)，表明分子的長(zhǎng)軸與短鏈DNA的堿基對(duì)間處于垂直的幾何位置，卟啉與DNA為插入的結(jié)合模式；出現(xiàn)一正一負(fù)的信號(hào)，說(shuō)明卟啉與DNA為外部堆積的結(jié)合模式。

圖4 DNA結(jié)合卟啉的CD光譜：（a）卟啉1，（b）卟啉2，（c）卟啉3Fig.4 Circular dichroism spectra of ct-DNA combined with porphyrin：（a）Por1，（b）Por2，（c）Por3

如圖4和表1所示，Por 1在409 nm處有一個(gè)較強(qiáng)的負(fù)峰，在446 nm處有一個(gè)強(qiáng)的正峰，同時(shí)在483 nm和493 nm處有兩個(gè)大小相同的正負(fù)峰，說(shuō)明Por 1與DNA結(jié)合模式為外部溝連和外部堆積并存。Por 2在427 nm，476 nm處有很強(qiáng)的負(fù)峰，說(shuō)明Por 2與DNA的主要結(jié)合模式為插入模式。Por 3在411 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)信號(hào)峰，而在431 nm～473 nm處有兩個(gè)較弱的正峰及480 nm與492 nm處的正負(fù)信號(hào)峰，說(shuō)明Por 3與DNA之間既有插入也有外部堆積的相互作用，且可能由于多個(gè)正電荷與DNA磷酸負(fù)離子骨架之間的相互作用存在著靜電作用［16］。這一結(jié)果與紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的ct-DNA滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié) 語(yǔ)

針對(duì)三種N，N-偶聯(lián)共軛雙卟啉化合物進(jìn)行了紫外可見(jiàn)吸收光譜，熒光發(fā)射光譜，圓二光色譜的DNA測(cè)試，通過(guò)觀察光譜變化值和誘導(dǎo)信號(hào)研究其與DNA的結(jié)合模式。結(jié)果表明，Por 1與DNA的結(jié)合模式是外部溝連以及外部堆積；Por 2能與DNA通過(guò)外部溝連模式作用，也可以插入到DNA中；Por 3可以插入DNA，并且能夠在DNA表面進(jìn)行自身堆積通過(guò)與DNA磷酸骨架的靜電相作用。以上結(jié)論為后續(xù)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，為共軛雙卟啉的研究提供理論依據(jù)。