彭京平，龐榮清，張 利

巴馬汀（PM）是從黃連中提取的多種活性生物堿之一，具有抗病原微生物、調(diào)節(jié)血壓、抗炎、增強機體免疫等多種藥理作用[1]。Ishikawa等[2]和Chen等[3]報道，該藥還具有抑制破骨細胞增殖和抑制骨吸收的作用，提示PM可能是潛在的抗骨質(zhì)疏松治療藥物。然而，上述研究未能充分明確PM抗骨質(zhì)疏松的分子機理，尤其是在調(diào)節(jié)骨髓間質(zhì)干細胞（BMSC）分化及促成骨方面的作用尚無報道。本研究探索了PM對BMSC成骨成脂分化相關(guān)標(biāo)志物的表達的調(diào)控作用，期望為進一步全面闡明PM抗骨質(zhì)疏松的藥理作用及相關(guān)藥物新功能開發(fā)提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鹽酸巴馬?。≒M，≥95%，大連美侖）；PCR 試劑盒（TAKARA）；DMEM（Hyclone）；CCK-8試劑盒（日本同仁）；TRIZOL（Hyclone）；FBS（Gibco）；BSA（Biosharp）；DMSO（Sigma）；大鼠外周血淋巴細胞分離液試劑盒（Solarbio）；抗 Runx2、ALP、COL1、OCN、PPARγ 和 Lpl抗體及二抗（Abcam）。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，2～3周齡（昆明醫(yī)科大學(xué)，許可證：SCXK-滇 2005-0008）。

1.3 研究方法

1.3.1 BMSC原代培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 BMSC分離、純化與鑒定：處死SD大鼠，無菌條件下取雙側(cè)脛、股骨，75%酒精浸泡20 min，PBS沖洗3次，去骨骺，以5 ml L-DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓，收集細胞懸液，按1∶1 加入大鼠淋巴細胞分離液（Ficoll，密度 1.083），2500 g、4℃、梯度離心20 min；吸取中間薄膜層細胞，加入新配 L-DMEM 調(diào)整細胞密度（1×108/ml），接種于培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。流式細胞儀分析BMSC表面標(biāo)記抗原，以CD29及CD44表達陽性、且CD14、CD34和CD45表達陰性細胞為BMSC。

BMSC誘導(dǎo)分化培養(yǎng)：取培養(yǎng)第3代的BMSC細胞誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)液為含有10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉及50 mg/L維生素C的培養(yǎng)液。

1.3.2 藥物母液制備 稱取PM標(biāo)準(zhǔn)品1178.25 μg，加入甲醇100 μl溶解，再加入DMEM溶液至10 ml，混合、搖勻，即得到母液。

1.3.3 CCK-8實驗確定PM的給藥濃度 取誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的BMSC制備細胞懸液（細胞密度4.0×104/ml），種入96孔板（置復(fù)孔6個），常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分別加入含不同濃度 PM（5、10、20、40、80、160、320 μmol/L）培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h；每孔加入 10 μl CCK-8試劑工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長下測定各孔吸光度，根據(jù)檢測結(jié)果確定后續(xù)實驗的PM濃度。

1.3.4 Real-time PCR法檢測成骨及成脂相關(guān)基因表達 取誘導(dǎo)分化完畢的BMSC制備細胞懸液（細胞密度1.5×105/ml），種入6孔板，隨機分為空白組、PM低濃度組、PM高濃度組，空白處理組以0.2%BSA溶液培養(yǎng)細胞；PM低、高濃度組分別以含有PM 40 μmol/L 或 80 μmol/L 的 0.2%BSA 溶液培養(yǎng)細胞。各組繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，1000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀；以Trizol提取細胞總RNA，采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以20 μl體系放入DNA擴增儀中擴增，檢測成骨相關(guān)基因Runx2、ALP、COL1、OCN 及成脂相關(guān)基因 PPARγ、Lpl的mRNA表達水平。以GAPDH為內(nèi)參基因，各目的基因與GAPDH的起始拷貝數(shù)比值表示各目的基因的相對表達量，實驗重復(fù)3次。相關(guān)內(nèi)參及目的基因引物見表1。

1.3.5 Western法檢測成骨及成脂相關(guān)蛋白表達誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSC按1.3.4進行分組并經(jīng)PM處理后，用蛋白裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，并以BCA法定量蛋白。隨后取50 μg已定量的蛋白樣品上樣分析，100 V恒壓轉(zhuǎn)移2 h后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將NC膜與一抗室溫孵育1 h；經(jīng)TBST緩沖液洗膜3次（10 min/次）后，加入二抗室溫孵育1 h，再以同樣方法洗膜3次。使用化學(xué)發(fā)光法顯影檢測目的蛋白表達量或磷酸化水平。實驗重復(fù)3次。

表1 相關(guān)基因PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 CCK實驗結(jié)果 根據(jù)CCK實驗結(jié)果，PM高濃度綜合選取位于峰值附近濃度以便于配置，即80 μmol/L，PM 低濃度組則減半選取 40 μmol/L。

2.2 PM對BMSC成骨相關(guān)標(biāo)志物基因表達的影響 低濃度和高濃度的PM均可顯著上調(diào)成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2、ALP、COL1和OCN的mRNA表達水平。其中低濃度PM對Runx2、ALP、COL1和OCN的mRNA表達上調(diào)幅度分別為91.3%、77.8%、41.2%和22.4%（P＜0.05），而高濃度PM上調(diào)幅度分別為 226%、206%、73.4%和 34.5%（P＜0.05）。 見圖1。

與對各基因表達調(diào)控結(jié)果類似，低濃度和高濃度的PM同樣可劑量依賴性上調(diào)Runx2、ALP、COL1和OCN蛋白表達。其中低濃度PM對Runx2、ALP、COL1和OCN的蛋白表達上調(diào)幅度分別為125%、93.9%、34.1%和 28.7%（P＜0.05），而高濃度 PM 表達上調(diào)幅度分別為291%、227%、61.6%和43.3%（P＜0.05）。 見圖 2。

2.3 PM對BMSC成脂相關(guān)標(biāo)志物基因表達的影響 與對成骨相關(guān)標(biāo)志物表達基因調(diào)控結(jié)果相反，PM低濃度和高濃度均可顯著抑制成脂相關(guān)標(biāo)志物PPARγ和Lpl的mRNA表達水平。其中低濃度PM對PPARγ和Lpl的mRNA表達抑制程度分別為25.9%和26.9%（P＜0.05），而高濃度PM對PPARγ和 Lpl的抑制程度分別為 52.8%和 43.8%（P＜0.05）。 見圖 3。

同樣，PM低濃度和高濃度均可顯著抑制成脂相關(guān)基因PPARγ和Lpl的蛋白表達水平。其中低濃度PM對PPARγ和Lpl的蛋白表達抑制程度分別為30.5%和30.9%（P＜0.05）；而高濃度PM抑制程度分別為53.2%和43.2%（P＜0.05）。見圖4。

圖1 PM對誘導(dǎo)分化的BMSC中成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2、ALP、COL1和OCN mRNA表達的影響

圖2 PM對誘導(dǎo)分化的BMSC中成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2、ALP、COL1和OCN蛋白表達的影響

3 討論

目前臨床上治療骨質(zhì)疏松的藥物根據(jù)其機理主要有兩大類[4]，分別是骨吸收抑制劑和骨形成促進劑。骨吸收抑制劑包括鈣制劑、雙膦酸鹽類、雌激素及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、維生素D及活性代謝物、降鈣素等，是目前治療骨質(zhì)疏松的主要藥物。然而此類藥物主要通過抑制破骨細胞的骨吸收作用，延緩骨量丟失，對于已經(jīng)丟失的骨組織無作用，不能有效地增加骨密度、改善骨結(jié)構(gòu)、降低骨折發(fā)生的風(fēng)險。骨形成促進劑主要為甲狀旁腺激素，人重組甲狀旁腺激素rhPTH(1-34)（Forteo）是現(xiàn)今唯一已上市的骨形成促進劑，但由于其具有增加高鈣血癥和骨肉瘤的危險，因此，大大限制了該藥的臨床使用[5]。因此，探索和開發(fā)新型骨形成促進劑是當(dāng)前的研究熱點。

傳統(tǒng)中藥在治療骨質(zhì)疏松、尤其是在調(diào)節(jié)骨代謝平衡方面具有一定的優(yōu)勢。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認為，骨質(zhì)疏松癥應(yīng)歸屬“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”等范疇，病因在于腎精不足、骨失滋養(yǎng)，進而導(dǎo)致的全身骨骼的慢性退行性改變。根據(jù)2015年中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識，六味地黃湯加黃柏是陰虛火旺證明顯的骨質(zhì)疏松患者的推薦方劑之一[6]。而PM、小檗堿等均是黃柏的主要成分，提示小檗堿類衍生物對相關(guān)證候所致骨質(zhì)疏松具有潛在預(yù)防和治療價值。此外，國外前期基礎(chǔ)研究也表明，黃連、黃柏等中藥中所含的小檗堿類衍生物，如PM、小檗堿、黃連堿等，均有著較好的抑制破骨細胞增殖和減緩骨吸收的作用[2,7]。根據(jù)以上中醫(yī)藥理論和前期的實驗工作基礎(chǔ)上，本研究首次發(fā)現(xiàn)，PM對BMSC具有明顯的促成骨、抑成脂的雙向調(diào)控功能，表明PM很可能是一種新的潛在的骨形成促進劑。值得關(guān)注的是，在本研究所涉及的成骨相關(guān)標(biāo)志物中，Runx2和ALP屬于骨形成早期的相關(guān)標(biāo)志基因，而COL1和OCN則屬于骨形成晚期標(biāo)志基因[8]。本研究結(jié)果顯示，雖然PM對上述基因表達均具有顯著的促進作用，但PM對成骨早期標(biāo)志物表達的促進作用（高濃度PM對Runx2和ALP mRNA和蛋白表達水平上調(diào)均超過對照3倍以上，見圖1A和B）卻顯著強于對晚期標(biāo)志物表達的促進作用（高濃度PM對COL1和OCN mRNA和蛋白表達水平上調(diào)均不足對照1倍，見圖1C和D），提示PM促進BMSC向成骨分化的作用可能主要在早期成骨分化階段，更確切的調(diào)控機制仍有待進一步研究確證。

圖3 PM對誘導(dǎo)分化的BMSC中成脂相關(guān)標(biāo)志物PPARγ和Lpl mRNA表達的影響

圖4 PM對誘導(dǎo)分化的BMSC中成脂相關(guān)標(biāo)志物PPARγ和Lpl蛋白表達的影響