柏 青，黃尤光，李 涓，邢小芳，李順序，黃 晶，王永梅

不明原因復發(fā)性流產(chǎn)(URSA)當前在臨床上比較常見，占反復流產(chǎn)的50%左右[1]。該病是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥3次自然流產(chǎn)，且不存在解剖、內(nèi)分泌、染色體和自身免疫功能異常以及生殖道感染等病因[2-3]。目前其具體的發(fā)病機制還不明確，導致治療效果不佳。胎盤絨毛血管的協(xié)調(diào)發(fā)育與妊娠結(jié)局顯著相關(guān)，多數(shù)流產(chǎn)產(chǎn)婦存在絨毛血管發(fā)育異常，表現(xiàn)為絨毛毛細血管數(shù)目減少或功能障礙[4-5]?，F(xiàn)代研究表明，胎盤內(nèi)皮增生過程中，血管機能不全可能是導致流產(chǎn)的原因之一。缺氧對滋養(yǎng)層細胞相關(guān)的侵襲和分化過程具有重要的調(diào)節(jié)作用，妊娠過程中的胎盤發(fā)生是在相對缺氧的環(huán)境中進行的，推測氧信號調(diào)節(jié)通路可能在流產(chǎn)的發(fā)病機制中發(fā)揮一定作用[6-7]。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是哺乳動物和人體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧時，能夠激活缺氧信號通路，使細胞適應缺氧環(huán)境，參與多種與血管形成有關(guān)的疾病[8-11]。本研究探討了HIF-1α信號通路參與胎盤內(nèi)皮增生的可能機制，希望有利于闡述不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 （1）觀察組：選擇2014年 2月～2018年2月在醫(yī)院診治的不明原因的反復自然流產(chǎn)產(chǎn)婦78例，納入標準：夫妻雙方染色體檢查正常；近3個月內(nèi)未使用過甾體類激素；連續(xù)自然流產(chǎn)＞3次，宮頸分泌物檢測支原體、衣原體為陰性；性激素和垂體激素正常；精液常規(guī)檢查無異常。排除標準：生殖器有器質(zhì)性病變；出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀且B超檢查提示孕囊無原始心血箭搏動；孕周≤12 w。（2）對照組：另選擇同期在本院門診行人工流產(chǎn)術(shù)產(chǎn)婦78例，納入標準：有至少一次的正常妊娠史，既往無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)及早產(chǎn)等異常孕育史；月經(jīng)周期28～30 d，月經(jīng)規(guī)律，量、色均正常；B超檢查提示胚胎發(fā)育正常；無先兆流產(chǎn)癥狀；排除感染及染色體、內(nèi)分泌、自身免疫異常等疾病。

兩組一般資料比較無顯著差異(P＞0.05，表1)。本研究得到了所有產(chǎn)婦的知情同意，醫(yī)院倫理委員會也批準了此次研究。

1.2 胎盤絨毛標本采集 胎盤娩出后，立即取胎盤母面中央絨毛組織塊約1 cm×1 cm×1 cm，漂洗后，用10%中性福爾馬林溶液固定≥24 h，梯度酒精脫水后石蠟包埋，采用5 μm連續(xù)切片，4℃保存。

1.3 免疫組化實驗 樣本采用常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化，修復抗原。PBS液洗×3次，3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。滴加正常山羊血清室溫孵育10 min，除非特異性染色。滴加濃度為1∶100兔抗人單克隆抗體VEGF、HIF-1α(一抗)，4 ℃過夜。PBS 液洗×3 次，滴加生物素標記山羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育15 min。PBS液洗×3次，滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液(酶標鏈親和素)，37℃孵育 15 min。PBS液洗×3次，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。以PBS替代第一抗體作為陰性對照，VEGF、HIF-1α蛋白主要表達于細胞胞漿及胞膜，部分可見細胞核著色，為淺黃至棕色顆粒，每例標本在400倍光鏡下隨意選取10個視野，計數(shù)視野中100個細胞中的陽性細胞數(shù)，取其平均數(shù)求為陽性百分率，積分 0～1 分為(－)；2～3 分為(+)；4～5 分為(++)；＞5分為(+++)，陽性率=[(++)+(+++)]例數(shù)/總例數(shù)×100%。將切片置于40倍顯微鏡下，確定染色最高血管密度區(qū)域；然后置于200倍顯微鏡下，選擇3個最高血管密度區(qū)進行微血管計數(shù)，求其平均值作為該患者的微血管密度(MVD)值。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.00統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，計數(shù)數(shù)據(jù)以頻數(shù)和百分率表示，組間比較分別行t檢驗或χ2分析；相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF和HIF-1α表達陽性率比較 觀察組VEGF和HIF-1α陽性率都低于對照組(P＜0.05，表2)。

2.2 MVD密度比較 觀察組MVD密度為(27.49±5.19)%，顯著低于對照組(39.58±4.59)%(P＜0.01)。

2.3 相關(guān)性分析 觀察組中，Spearman等級相關(guān)分析顯示，MVD與VEGF、HIF-1α陽性率呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，VEGF與HIF-1α陽性率呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。見表3。

表1 兩組一般資料比較(n=78)

表2 兩組VEGF和HIF-1α陽性率比較(n=78,%)

表3 觀察組相關(guān)性結(jié)果(r,n=78)

3 討論

成功的妊娠取決于良好的胎盤生長和發(fā)育，包括胚胎形成、胎兒發(fā)育及其與母體內(nèi)適應性改變[12]。胎兒發(fā)育所需的營養(yǎng)全部來自于胎盤，胎盤內(nèi)皮增生和功能調(diào)節(jié)是保證胎兒從母體獲得充足氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵，因此，胎盤的形成是妊娠成功的關(guān)鍵[13]。相關(guān)研究表明，妊娠早期胎盤發(fā)育是在相對缺氧的環(huán)境中，胎盤局部氧感受和信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)對胎盤內(nèi)皮增生發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[14-15]。HIF-1能轉(zhuǎn)錄活性核蛋白，主要參與調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)。VEGF為一種同型二聚體糖蛋白，在血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合生長因子受體，促進血管的再生，對維持血管的正常形態(tài)和功能有積極作用[16]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組VEGF和HIF-1α陽性率都低于對照組，Spearman等級相關(guān)分析顯示VEGF與HIF-1α陽性率呈顯著正相關(guān)，說明不明原因的反復自然流產(chǎn)可能與VEGF與HIF-1α的低表達有關(guān)。從機制上分析，HIF-1α可上調(diào)VEGF相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促進血管增生，適應缺氧[17]。在缺氧時，內(nèi)皮細胞產(chǎn)生HIF-1α，誘導VEGF和一些糖酵解相關(guān)酶的表達，使血管增生，增加供氧、供血和能量，改善缺氧環(huán)境[18-19]。HIF-1α可廣泛參與哺乳動物細胞中缺氧誘導產(chǎn)生的特異應答，調(diào)控多種基因的缺氧誘導表達，機體對缺氧產(chǎn)生適應。如果HIF-1α低表達，下游靶基因的調(diào)控活性會下降，胎盤增生出現(xiàn)障礙，滋養(yǎng)細胞表型轉(zhuǎn)換障礙，影響胎盤正常功能的發(fā)揮，HIF-1α調(diào)節(jié)VEGF過程出現(xiàn)障礙，胎盤內(nèi)皮不良增生，影響胚胎著床及早期發(fā)育，從而導致不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組胎盤絨毛組織的MVD密度低于對照組，表明不明原因的反復自然流產(chǎn)可能與胎盤絨毛組織的微血管密度低有關(guān)。從機制上分析，胎盤微血管發(fā)育不良及血管密度減少，造成母體與胎兒血氧等物質(zhì)交換障礙，胎盤發(fā)育受阻而導致流產(chǎn)，表明MVD減少是造成流產(chǎn)的的原因之一[20]。Spearman等級相關(guān)分析顯示，觀察組的MVD密度與VEGF、HIF-1α陽性率呈顯著正相關(guān)性，提示反復自然流產(chǎn)孕婦胎盤組織MVD密度降低可能是由VEGF、HIF-1α低表達引起的。人體早期的胎盤內(nèi)皮增生是發(fā)生在一個相對缺氧的環(huán)境中，其增生發(fā)育經(jīng)歷了一個氧濃度從低到高的梯度變化過程，氧濃度的變化可能是滋養(yǎng)細胞分化及胎盤血管網(wǎng)形成過程中一個重要的調(diào)節(jié)因素。氧濃度較低時，滋養(yǎng)細胞開始增殖；氧濃度較高時，分化侵襲表型的滋養(yǎng)細胞，慢慢浸潤到子宮內(nèi)膜，使血管再生，為胎兒提供發(fā)育所需的營養(yǎng)[21]。本研究表明，絨毛組織中VEGF與HIF-1α的低表達會導致滋養(yǎng)細胞的表型轉(zhuǎn)換障礙、血管生成受阻、血管密度減少，從而引起血管重鑄障礙，胎盤灌注不足引起流產(chǎn)。

總之，胎盤內(nèi)皮增生是胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)，HIF-1α信號通路可能參與胎盤內(nèi)皮增生過程，其低表達可能與不明原因復發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)。