王遼菊，朱麗紅，邰迎春

妊娠期糖尿病(GDM)是指妊娠期首次出現(xiàn)糖耐量受損或糖尿病的疾病，是產(chǎn)科的常見病[1]。家族中母親患有糖尿病，子代糖尿病的發(fā)病率較高。女性在妊娠期或哺乳期出現(xiàn)高血糖，且血糖得不到有效控制時(shí)，其后代成年后代謝疾病的發(fā)病率明顯增加[2]。GDM會(huì)使得子宮呈現(xiàn)高糖環(huán)境，其可能是子代成年后糖脂代謝紊亂的高危險(xiǎn)因素。以往多是對(duì)妊娠期中后期輕度糖尿病對(duì)子代影響的研究，本研究通過建立妊娠期重度高血糖（即血糖＞15 mmol/L）大鼠GDM模型，探討對(duì)子代糖脂代謝的影響，并探討其發(fā)生機(jī)制，以為GDM的防治措施研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 鏈脲佐菌素（美國Sigma公司），人胰島素注射液（諾和諾德制藥有限公司），血糖儀（強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司），酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（美國R&D公司），miRNA RT-PCR試劑盒（上海生工生物）。

1.2 構(gòu)建妊娠期高血糖動(dòng)物模型 選擇30只8周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠，購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SCXK 2017-007），體重 200～250 g。 飼養(yǎng)環(huán)境：普通飼料喂養(yǎng)，溫度（22±1）℃，濕度 60%±5%，照明12 h。隨機(jī)平均分為觀察組與對(duì)照組。均與健康雄性SD大鼠交配，次日清晨觀察雌鼠陰道，若能觀察到陰栓，則為妊娠第0 d。在妊娠第1 d：觀察組單次腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素，構(gòu)建妊娠期高血糖動(dòng)物模型；對(duì)照組則腹腔注射同體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.5）。觀察組分別于妊娠期第5、12、19 d及分娩后第7 d，4次空腹采尾尖靜脈血，血糖儀檢測血糖值，如均＞15 mmol/L，則為妊娠期高血糖造模成功。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 兩組子代血糖值比較 兩組分娩后，幼鼠正常喂養(yǎng)，分別記為子代觀察組（21只）及子代對(duì)照組（25只）。分別在分娩后7 d和喂養(yǎng)20 w時(shí)，進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（GTT）：子代大鼠禁食16 h，并保持飲水充足，環(huán)境干燥、清潔，給予每只大鼠腹腔注射2 g/kg 的葡萄糖溶液，在注射后的第 0、30、60、90 及120 min，通過尾尖取血測量血糖值。

1.3.2 兩組子代血脂水平比較 兩組喂養(yǎng)至子代21 w時(shí)處死，收集血液樣本，4℃、3000 r/min離心15 min，檢測血清血脂水平，包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）與低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。依據(jù)《血脂異常防治建議》的判定標(biāo)準(zhǔn)確定異常臨界值[3]：即 TC＞5.57 mmol/L，T≥1.7 mmol/L，HDL-C＜0.91 mmol/L，LDL-C＞3.64 mmol/L。

1.3.3 兩組子代肝臟相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較子代大鼠處死后，迅速取出肝臟，提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARα）、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶 1α（CPT-1α）、3-羥基酰基輔酶 A 脫氫酶（Ehhadh）、長鏈酯酰輔酶 A 合成酶 3（ASL3）、miRNA-214、miRNA-130a、miRNA-181a、miRNA-34a等基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組子代GTT血糖值比較 GTT結(jié)果顯示，分娩后7 d，兩組子代血糖比較無顯著差異（P＞0.05）；但喂養(yǎng)20 w時(shí)，子代觀察組的血糖水平顯著高于子代對(duì)照組（P＜0.05，表 1）。

表1 兩組子代GTT全血血糖值比較

表2 兩組子代血脂水平比較(mmoI/L)

表3 兩組子代肝臟相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 兩組子代血清血脂水平比較 喂養(yǎng)21 w時(shí)，子代觀察組的TC、TG和LDL-C水平顯著高于子代對(duì)照組（P＜0.05），而HDL-C明顯低于子代對(duì)照組（P＜0.05，表 2）。

2.3 兩組子代肝臟相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較 喂養(yǎng)21 w時(shí)，子代觀察組肝臟PPARα和Ehhadh相對(duì)表達(dá)量顯著高于子代對(duì)照組 （P＜0.05），miRNA-130 a和ASL3明顯低于子代對(duì)照組（P＜0.05），而兩組肝臟 CPT-1α、miRNA-214、miRNA-181a 及 miRNA-34a則無顯著差異（P＞ 0.05，表 3）。

3 討論

以往文獻(xiàn)多偏重于妊娠中后期輕微妊娠期糖尿病大鼠對(duì)子代的影響研究，本研究選擇妊娠期血糖＞15 mmol/L的嚴(yán)重妊娠期糖尿病大鼠，探討其對(duì)子代成年大鼠糖脂代謝的影響，并從miRNA層面探討其發(fā)生機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組子代大鼠GTT血糖值在分娩后7 d無顯著差異，而在喂養(yǎng)20 w時(shí)，子代觀察組明顯高于子代對(duì)照組，表明妊娠期重度糖尿病可引起子代成年后血糖紊亂。而在21 w時(shí)的血清血脂水平比較，子代觀察組的TC、TG、HDL-C與LDL-C與子代對(duì)照組對(duì)比均有差異，說明妊娠期重度糖尿病引起子代成年后血脂水平異常的風(fēng)險(xiǎn)增大。

妊娠期高血糖大鼠是如何對(duì)子鼠出生及成年以后的糖脂代謝產(chǎn)生影響的，目前尚不清楚，本研究從肝臟相關(guān)基因表達(dá)差異上進(jìn)行了探討。miRNA是單鏈非編碼小RNA，調(diào)節(jié)mRNA翻譯，抑制靶mRNA剪接或翻譯來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-214、miRNA-130a、miRNA-181a、miRNA-34a 對(duì) 糖 代 謝 調(diào)控有重要作用，其中miRNA-130a在大鼠高糖時(shí)，其表達(dá)水平會(huì)下降。在胰島細(xì)胞中敲除miRNA-130a基因后，可對(duì)葡萄糖刺激的胰島素釋放產(chǎn)生抑制作用[5]。本研究結(jié)果表明，子代觀察組的miRNA-130a表達(dá)量明顯低于子代對(duì)照組，表明妊娠期糖尿病母鼠會(huì)對(duì)子代的miRNA-130a基因產(chǎn)生明顯影響，從而影響子代的糖代謝。

肝臟作為機(jī)體脂代謝的核心器官，對(duì)脂質(zhì)的攝取、合成、分解及輸出有調(diào)控作用，其中PPARα、CPT-1α、Ehhadh、ASL3 對(duì)脂代謝調(diào)控有重要作用[6]。PPARα基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，會(huì)降低線粒體β的氧化能力，增加脂代謝疾病的易感性[7]；ASL3過表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞攝取脂肪酸，是調(diào)控脂質(zhì)合成的一個(gè)重要信號(hào)分子[8]；胚胎發(fā)育早期惡劣的母體環(huán)境，子代肝臟內(nèi)的Ehhadh基因出現(xiàn)代償性表達(dá)增加，脂肪酸β的氧化增加，降低肝內(nèi)脂肪酸含量[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，子代觀察組的PPARα、Ehhadh明顯高于子代對(duì)照組，ASL3明顯低于子代對(duì)照組，表明妊娠期糖尿病會(huì)影響子代的 PPARα、Ehhadh、ASL3基因水平，從而影響子代脂代謝。

綜上所述，妊娠期重度糖尿病可引起子代成年后糖脂代謝紊亂，而肝臟相關(guān)基因表達(dá)異?？赡苁翘侵x紊亂的原因，應(yīng)進(jìn)一步研究證實(shí)。