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(西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

八仙花屬(Hydrangea)又名繡球?qū)?，是繡球科中最大的屬，原產(chǎn)我國，栽培歷史悠久，全世界大約有73個種[1-2]，我國有47種和11變種[3]。八仙花花形豐滿有致，花色種類繁多，且花色可隨基質(zhì)和水分酸堿度變化而變化，觀賞期長達6個月左右，觀賞性極佳，主要用作盆花[4-5]、切花[6-7]和干花[8]，在園林中也應(yīng)用廣泛[9-10]，此外還具有藥用價值[11-15]與生態(tài)價值[16-17]。目前歐洲地區(qū)的八仙花新品種選育研究處于世界領(lǐng)先地位，已選育出500多個八仙花栽培品種，我國八仙花盆花和切花品種均從國外引進，育種工作嚴(yán)重落后，國內(nèi)關(guān)于八仙花新品種選育研究的報道很少[3]。

目前，國內(nèi)有關(guān)八仙花的研究主要集中在種質(zhì)資源[18]、引種馴化[19-20]、繁殖栽培[21-22]、花期調(diào)控[23]、化學(xué)分析[24]等方面，而關(guān)于該屬植物分類研究的指標(biāo)一般是從最初的表現(xiàn)形態(tài)學(xué)性狀方面進行的，很少有利用分子標(biāo)記技術(shù)對八仙花品種分類的系統(tǒng)研究[25-26]。李艷香[27]采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)研究了繡球?qū)僦参锏?1份野生種和8份栽培品種的親緣關(guān)系。

ISSR是一種多態(tài)性高且方便快捷的分子標(biāo)記技術(shù)，目前在多種植物的親緣關(guān)系研究和遺傳多樣性研究的應(yīng)用極為廣泛[28-32]，而利用ISSR分子標(biāo)記對八仙花品種的親緣關(guān)系的研究尚未見報道。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了14個八仙花品種的親緣關(guān)系，以期為八仙花新品種的雜交選育提供分子水平的理論依據(jù)。

表2 對14個品種樣本進行擴增的ISSR引物

引物序列(5’-3’)退火溫度(℃)擴增條帶總數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)百分比(%)UBC900 ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA 53665583.33UBC854TCT CTC TCT CTC TCT CRG535050100UBC891HVH TGT GTG TGT GTG TG53514791.67UBC834AGA GAG AGA GAG AGA GYT53534483.33UBC876GAT AGA TAG ACA GAC A53666091.67UBC895 AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC53514791.67UBC843CTC TCT CTC TCT CTC TRA53676191.67UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A53745675總計478420

1 材料和方法

1.1 采 樣

實驗材料采集于八仙花栽培溫室，所用植物材料來自昆明楊月季園藝有限責(zé)任公司(表1)，按照種群采樣法采集樣本，每個品種采集10個樣本，在液氮中速凍后-70 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 14個八仙花品種的名稱

編號名稱學(xué)名1花園蕾絲H.‘Huayuanleisi’2愛莎H.‘Aisha’3無盡夏新娘H.‘Wujinxiaxinniang’4紫水晶H.‘Zishuijin’5月亮石H.‘Yueliangshi’6精靈H.‘Jingling’7寶石H.‘Baoshi’8蒂沃利H.‘Diwoli’9羅斯H.‘Luosi’10阿爾卑斯山H.‘Aerbeisishan’11經(jīng)典紅H.‘Jingdianhong’12綠色夏天H.‘Lvsexiatian’13圣代草莓H.‘Shengdaicaomei’14粉鉆H.‘Fenzuan’

1.2 樣品總DNA提取

將-70 ℃儲存的葉片取出后加液氮研磨，利用試劑盒提取葉片總基因組DNA，利用紫外分光光度計(Bio-RAD SmartpecMT 3000)檢測總DNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA質(zhì)量，并將其用ddH2O稀釋至50 ng/μL在-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選及擴增

實驗采用ISSR引物為沃爾森生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司參照哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的ISSR引物序列所合成，在49條植物通用引物中用每個品種的八仙花DNA樣本進行篩選，選出了適合八仙花PCR擴增的8條重復(fù)性好且擴增條帶清晰的引物(UBC 900、UBC 854、UBC 891、UBC 834、UBC 876、UBC 895、UBC 843、UBC 873)。

利用PCR儀(北京君意公司生產(chǎn))進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：1μL引物(10μmol/L)、1μL總DNA(50 ng/μL)、10.5μL ddH2O、 12.5μLTaqmix。首先94 ℃預(yù)變性5 min，經(jīng)過94 ℃ 45 s、53 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s進行45個循環(huán)，72 ℃延伸8 min后于4 ℃冰箱保存。

PCR擴增結(jié)束后，以100 bpDNA ladder為參照，在2%瓊脂糖凝膠濃度下進行1.5 h 110 V恒壓電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司)拍照保存和記錄數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)擴增得到的電泳圖譜，將每一處DNA擴增條帶視為一個引物結(jié)合位點，在同一水平位置處，有DNA片段遷移記為1，無則記為0，利用Excel軟件統(tǒng)計0-1矩陣。再利用POPGENE 1.32軟進行遺傳參數(shù)分析，計算多態(tài)位點百分率(PPB，percentage of polymorphic bands)、有效等位基因(Ne，effective number of alleles)，Nei’s基因多樣性(H，Nei’s gene diversity)、Shannon’s 信息指數(shù)(I，Shannon’s information index)等參數(shù)[39]。然后使用NTSYSpc 2.1軟件非加權(quán)配對算數(shù)平均法(UPGMA)對Nei’s遺傳距離進行聚類分析[40]，獲得14個八仙花品種親緣關(guān)系的樹狀圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 ISSR擴增產(chǎn)物多態(tài)性分析

通過14個八仙花品種DNA對UBC 49條植物通用引物進行擴增篩選，得到適用于八仙花PCR擴增的8個引物(表2)，得出了條帶清晰、帶型豐富的電泳圖譜(圖1)。利用這8個引物分別對14個八仙花品種的樣本DNA進行擴增，共有478條擴增條帶，包括420條多態(tài)性條帶；共有位點124個，多態(tài)性位點百分率為88.54%。

利用POPGENE 1.32軟件計算有效等位基因(Ne)，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)對數(shù)據(jù)進行分析和計算，結(jié)果表明，試供八仙花品種平均有效等位基因(Ne)為1,419 1(0.196 1)，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.282 4(0.103 2)、平均Shannon’s 信息指數(shù)(I)為0.448 6(0.131 8)。

表3 14個八仙花品種的遺傳距離(對角線下)和遺傳相似性系數(shù)(對角線上)

12345678910111213141****0.95570.93820.96240.96340.95060.96340.97410.99980.95590.93730.96140.99980.955520.0453****0.94850.95430.97730.93000.97730.93570.95530.99980.94700.95280.95490.999130.06370.0529****0.97710.95190.91980.95160.94570.93970.94900.99970.97660.93830.949240.03840.04680.0232****0.96000.94880.96000.96190.96150.95500.97700.99980.96270.955450.03730.02290.04930.0409****0.91691.00000.95680.96180.97620.94960.95770.96170.974660.05070.07260.08360.05250.0867****0.91690.91630.95110.93000.91880.94780.95020.929770.03730.02290.04930.04090.00020.0867****0.95680.96180.97620.94960.95770.96170.974680.02620.06650.04480.03890.04420.08740.0442****0.97240.93500.94000.96010.97300.933890.00020.04570.06220.03920.03890.05010.03890.0280****0.95540.93880.96060.99950.9551100.04510.00020.05230.04600.02410.07250.02410.06720.0456****0.94810.95400.95540.9998110.06470.05440.00030.02330.05170.08470.05170.05770.06320.0533****0.97700.93790.9487120.03940.04840.02360.00020.04330.05360.04330.04070.04020.04710.0233****0.96220.9548130.00020.04620.06370.03800.03910.05110.03910.02730.00050.04560.06410.0385****0.9556140.04550.00090.05220.04560.02570.07290.02570.06850.04590.00020.05260.04620.0454****

注：1～14為14個八仙花品種。圖1 引物UBC 900對14個八仙花品種的ISSR擴增電泳圖

2.2 品種間親緣關(guān)系分析

采用POPGENE 1.32軟件進行遺傳參數(shù)分析結(jié)果表明，14個八仙花品種間的遺傳距離為0.000 2～0.087 4，遺傳相似性系數(shù)為0.916 3～1.000 0；精靈和蒂沃利間的遺傳距離最大，花園蕾絲和圣代草莓之間的遺傳距離最小。

2.3 品種間聚類分析

由14個八仙花品種遺傳相似性系數(shù)的聚類樹形圖(圖2)可知，14個八仙花品種在相似性系數(shù)約為0.38 處被明顯地聚成兩類。類群Ⅰ中包含花園蕾絲、綠色夏天和圣代草莓，類群Ⅱ包含其余11個品種(愛莎、精靈、粉鉆、無盡夏新娘、蒂沃利、寶石、阿爾卑斯山、經(jīng)典紅、紫水晶、羅斯、月亮石)。在相似性系數(shù)約為0.61處，類群Ⅱ可分為兩個亞類群，亞類群Ⅱa包括愛莎、精靈和粉鉆，亞類群Ⅱb在相似性系數(shù)約為0.89處又可分為3個小組，小組1包括無盡夏新娘、蒂沃利2個品種，小組2包括寶石、阿爾卑斯山、經(jīng)典紅3個品種，小組3包括紫水晶、羅斯、月亮石3個品種。

圖2 14個八仙花品種的遺傳相似性系數(shù)聚類分析圖

3 結(jié)論與討論

八仙花屬植物的分類研究始于1867年，Maximowicz[33]首次根據(jù)植物習(xí)性和花瓣分離或連合將該屬植物分為繡球組(Sect.Euhydrangea)和冠蓋組(Sect.CalyprantheMaxim.)，此后，Rehder[34]、Engler[35]、陳煥鏞[36]、McClintock[37]、衛(wèi)兆芬[1]等都曾修訂過該屬植物的分類，但對該屬植物的研究僅限于形態(tài)描述，且現(xiàn)有的關(guān)于屬內(nèi)部分品種的分類是以花瓣萼的顏色和外形作為依據(jù)來劃分的，因此，對于品種的分類有必要借助分子標(biāo)記技術(shù)進一步補充完善。

ISSR是一種基于微衛(wèi)星發(fā)展起來的十分有效的新型分子標(biāo)記，可對簡單重復(fù)序列間的遺傳信息進行多態(tài)性擴增，具有高效穩(wěn)定的優(yōu)點[38]，因此該檢測方法可對傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類起到補充作用。本實驗中使用篩選所得的8個引物對14個八仙花品種進行擴增，多態(tài)性條帶百分比(PPB)為75%，平均Nei’s 基因多樣性指數(shù)為0.282 4，品種間的差異導(dǎo)致ISSR擴增位點的多態(tài)性，說明14個八仙花品種間的遺傳變異較為豐富。

本實驗通過POPGENE軟件分析數(shù)據(jù)，所得14個八仙花品種間的遺傳距離為0.000 2～0.087 4，遺傳相似性系數(shù)為0.916 3～1.000 0，這些數(shù)據(jù)表明，這14個品種親緣關(guān)系較近，在聚類分析中可以被聚到一起，且有明顯分組。

利用NYSYSpc 2.1軟件對14個品種進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在遺傳相似性系數(shù)約0.38處可明顯地聚成兩類，其中類群Ⅰ包含花園蕾絲、綠色夏天和圣代草莓。 從花序形態(tài)差異方面來看，花園蕾絲、綠色夏天與圣代草莓花序呈圓錐狀頂生，具有大量不孕花，屬于圓錐繡球(Hydrangeapaniculata)的栽培變種，又稱大花圓錐繡球；其他品種的花多呈半球形花序(寶石、阿爾卑斯山、紫水晶、月亮石、無盡夏新娘)、傘房花序(愛莎)和傘形花序(經(jīng)典紅)，這與聚類結(jié)果基本符合。 由此可見，形態(tài)學(xué)分類可作為親緣關(guān)系研究的輔助手段。在類群Ⅱ的基礎(chǔ)上，從不孕花萼瓣長度和花序直徑來看，月亮石、紫水晶花型中等(12～17 cm)，無盡夏新娘、寶石、經(jīng)典紅、阿爾卑斯山花型偏大(14～21 cm)，說明遺傳相似性聚類與其形態(tài)分類有部分一致性；而在亞類群Ⅱa中，愛莎、精靈與粉鉆雖被聚為一類，但遺傳相似性較低，在形態(tài)學(xué)分類上差異較大。在亞類群Ⅱb中，從花色來看，無盡夏新娘為純白至淡粉色系，經(jīng)典紅、阿爾卑斯山為玫紅色系，月亮石、寶石、羅斯為藍紫色系，紫水晶為綠邊紫色系復(fù)色花，蒂沃利為白粉色系復(fù)色花，這與聚類分析不完全一致。從生理特性來看，無盡夏新娘可在嫩枝上分化花芽，花期比普通八仙花平均長10～12周，耐寒性好于其他品種，但在聚類結(jié)果中未顯示出良好的區(qū)分度。研究結(jié)果還表明，14個八仙花品種基因型具有高度雜合性，難以建立基因位點與主要表型性狀的聯(lián)系，還未發(fā)現(xiàn)一些與形態(tài)特征相關(guān)的特意擴增片段，因此ISSR可作為形態(tài)學(xué)分類的輔助手段。

我國八仙花資源豐富，但研究起步晚，選育新品種的工作嚴(yán)重滯后，而且對于引進的新品種欠缺了解，不利于選育工作的開展。本研究利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對14個八仙花品種的親緣關(guān)系進行了初步分析，為進一步研究八仙花品種的分類提供了分子水平的理論依據(jù)，同時也為八仙花新品種的選育提供了參考。