劉 科 施赫赫 譚巧燕 陳 淦 唐小江

(1. 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心，佛山 528248)(2. 廣東貝格生物科技有限公司，佛山 528100)

融水小型豬是源自廣西融水縣苗寨的小黑豬，具有體型小、性情溫馴、母性較好、產(chǎn)仔力強(qiáng)等特點(diǎn)，具有培育成標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗用小型豬的有利特點(diǎn)[1]。我們于2012 年將該豬種源引到廣東三水繁育，建立了基礎(chǔ)種群的系譜檔案，已繁殖出F1 代和F2 代，參照北京市地方標(biāo)準(zhǔn)[2]初步建立了融水小型豬的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并開展了融水小型豬實(shí)驗動物化研究，包括環(huán)境、營養(yǎng)、生長、生理生化、組織病理、線粒體DNA結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化等[1, 3-6]。為了進(jìn)一步掌握融水小型豬群體遺傳結(jié)構(gòu)，本文通過STR(Short tandem repeat)掃描技術(shù)分析了融水性小型豬F1代群體的遺傳結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物樣品：在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心小型豬研究基地融水小型豬F1代群體中隨機(jī)抽取非同窩的30頭，年齡性別不限。各融水小型豬具體信息見表1。

1.1.2儀器及試劑：EDC-810 PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；3730XL基因測序儀，ABI公司；Allegra 25R臺式高速冷凍離心機(jī)，Beckman(貝克曼)公司；GeneScanTM-120 GeneScan，ABI公司； Taq DNA 聚合酶、dNTP購于Fermentas公司；ROX標(biāo)記分子量內(nèi)標(biāo)、GK1041，上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 融水小型豬樣本信息

1.1.3STR位點(diǎn)：選用北京市地方標(biāo)準(zhǔn)封閉群實(shí)驗用小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測提供的25個微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物序列，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成引物。具體位點(diǎn)名稱、引物序列及PCR反應(yīng)條件見表2。

表2 25個STR位點(diǎn)名稱、引物序列、片段大小及PCR條件

1.2 方法

1.2.1DNA提?。河脽o菌EDTA抗凝采血管取融水小型豬前腔靜脈血4 mL，用上海捷瑞生物工程有限公司生產(chǎn)的GK1041試劑盒按操作說明書提取DNA。

1.2.2PCR及瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應(yīng)體系為15 μL，其中10×buffer 1.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，DNTP 10 m mol/L 0.3 μL，Taq酶0.3 μL，5～10 ng基因組DNA 1μL，純水(H2O)：10.25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性15 s，最適退火溫度15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，接72 ℃繼續(xù)延伸3 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。取部分?jǐn)U增產(chǎn)物8 μL經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，成相拍照。

1.2.3STR掃描: 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果估計PCR產(chǎn)物濃度，并將產(chǎn)物稀釋10倍后，與ROX 500內(nèi)標(biāo)混勻，其中10倍稀釋的PCR產(chǎn)物1.5 μL，ROX標(biāo)記的分子量標(biāo)記0.25 μL，超純?nèi)ルx子甲酰胺12.5 μL，95 ℃ 5 min，迅速冰浴3 min，置于ABI3730測序儀樣本架上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。本次實(shí)驗檢測為三色通道熒光檢測體系，分別為FAM、HEX、ROX，實(shí)現(xiàn)每通道同時檢測兩種STR類型(根據(jù)標(biāo)記的不同，這里為FAM和HEX)。

1.2.4STR掃描結(jié)果分析：掃描結(jié)果若只有一個主波的為純合基因型，如果有兩個主波則為雜合基因型。同時將每個STR掃描標(biāo)記的基因片段大小按照由小到大的順序分別標(biāo)記為a、b、c、d、e等。將30頭融水小型豬的25個微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型按照aa、ab、bc等格式輸入Popgene32軟件，分析融水小型豬觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)、有效雜合度等。

2 結(jié)果

2.1 25個位點(diǎn)PCR電泳凝膠圖

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，全部25個位點(diǎn)擴(kuò)增良好，電泳條帶清晰，電泳凝膠結(jié)果見圖1。

圖1 25個位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 STR掃描結(jié)果

STR掃描結(jié)果顯示，全部25個微衛(wèi)星位點(diǎn)具有豐富的多態(tài)性，純合及雜合基因型從掃描圖中清晰可見。SW951位點(diǎn)STR掃描結(jié)果(選取2個個體)見圖2、3。

圖2 SW951位點(diǎn)純合子基因型STR掃描結(jié)果

圖3 SW951位點(diǎn)雜合子基因型STR掃描結(jié)果

2.3 融水小型豬群體遺傳分析結(jié)果

將從STR掃描得到的信息輸入Popgene32后分析得到30頭融水小型豬在25個位點(diǎn)上的觀測等位基因數(shù)，有效等位基因數(shù)，香隆指數(shù)及有效雜合度原始數(shù)據(jù)及匯總見表3。30頭融水小型豬在25個位點(diǎn)上的平均觀測等位基因數(shù)為9.4400，平均有效等位基因數(shù)為5.2966，平均香隆指數(shù)為1.8085，平均有效雜合度為0.7737。

表3 30頭融水小型豬在25個位點(diǎn)上的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)、有效雜合度

3 討論

微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat, STR)或稱簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats, SSR)，是一種以2～6個核苷酸為基本重復(fù)單位的簡單串聯(lián)重復(fù)序列。近年來，微衛(wèi)星標(biāo)記因具有分布廣、數(shù)量多、高度多態(tài)性、具有共顯性等優(yōu)點(diǎn)，被作為一種重要的遺傳工具廣泛應(yīng)用于各類實(shí)驗動物的遺傳檢測和評定研究。特別是近年來快速發(fā)展和具有廣泛應(yīng)用前景的DNA全自動測序儀的毛細(xì)管凝膠電泳新技術(shù)(STR掃描技術(shù))，具有微量、高度自動化、結(jié)果更加準(zhǔn)確等明顯優(yōu)勢，成為微衛(wèi)星檢測的發(fā)展方向。本試驗選用北京市地方標(biāo)準(zhǔn)封閉群實(shí)驗用小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(DB11/T 828. 3—2011)提供的25個微衛(wèi)星位點(diǎn)，對建立的融水小型豬F1代群體進(jìn)行遺傳檢測，其位點(diǎn)引物涵蓋了小型豬17對常染色體及X性染色體，試驗結(jié)果顯示，18對染色體均得到對應(yīng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，全部25個位點(diǎn)擴(kuò)增良好，均可擴(kuò)增出目的條帶，電泳條帶清晰，對30個融水小型豬樣本檢測，各位點(diǎn)多態(tài)豐富，25個位點(diǎn)觀察等位基因數(shù)5～16，有效等位基因數(shù)2.3407～10.1695，平均有效等位基因數(shù)為5.2966，等位基因較多，表明選取的25個微衛(wèi)星位點(diǎn)適用于融水小型豬遺傳結(jié)構(gòu)分析。

融水小型豬是源自廣西融水縣苗寨的小黑豬，前期研究表明[1,3-6]，融水小型豬具有體型微小、性情溫馴、母性較好、產(chǎn)仔力強(qiáng)等特點(diǎn)，具有培育成標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗用小型豬的有利特點(diǎn)。我們于2012年將該豬種源引到廣東繁育，建立基礎(chǔ)群130頭，其中雌性120頭，雄性10頭。經(jīng)馴化、選育，建立了F1代融水小型豬群體。目前，已對融水小型豬繁殖群體進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，但群體的遺傳結(jié)構(gòu)還不清楚。本試驗所選取的30頭F1代融水小型豬個體(抽樣F1代群體120頭，雌性90頭，雄性30頭)年齡在1年到3年之間，樣本選擇盡可能避免親緣關(guān)系較近個體，基本能夠反應(yīng)目前融水小型豬群體的總體遺傳概況。試驗結(jié)果顯示，30頭F1融水小型豬在25個平均觀測等位基因數(shù)為9.4400，平均有效等位基因數(shù)為5.2966，說明群體非近親繁殖，基因較穩(wěn)定。香隆指數(shù)是衡量微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的指標(biāo)，香隆指數(shù)高則表明該微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性越好[7]。該融水小型豬F1代群體的平均香隆指數(shù)為1.8085，是屬理想范圍，這也與微衛(wèi)星多態(tài)性豐富的數(shù)據(jù)分析結(jié)果相吻合。群體平均有效雜合度是一個群體遺傳多樣性程度的重要指標(biāo)，能夠反映群體中檢測的基因的雜合狀態(tài)。一個理想封閉群的平均有效雜合度在0.5～0.7，若群體雜合度小于0.5則表明群體的遺傳多樣性較差，而大于0.7則表明群體離散度較高，個體間差異偏大[7-9]。該試驗用平均有效雜合度為0.7737，雜合度略偏高，這可能與種源個體來源，及該種群引入后第一代采用分組交配方式繁殖，封閉繁育代數(shù)較少，還未形成封閉群相關(guān)，同時說明建立融水小型豬封閉群還需進(jìn)一步培育、繁殖。

本實(shí)驗通過STR掃描技術(shù)分析了融水小型豬的遺傳結(jié)構(gòu)，為融水小型豬實(shí)驗動物化和標(biāo)準(zhǔn)化研究奠定了基礎(chǔ)，有利于融水小型豬群今后繁殖育種計劃的制定，同時也為小型豬遺傳分析方法提供了參考和依據(jù)。