趙培琨 龔菁菁 杜小燕 李長龍 霍學(xué)云 路 靜 呂建祎 劉 欣 陳振文 郭 萌

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

糖尿病(Diabetes mellitus)是當(dāng)今全球范圍威脅人類健康的重大疾病之一，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后另一個(gè)嚴(yán)重危害人類健康的重要慢性非傳染性終身疾病。隨著國人生活方式發(fā)生改變和老齡化進(jìn)程的加速，我國糖尿病的患病率呈現(xiàn)顯著上升趨勢。近年來，我國成人糖尿病患病率平均為11.6%，患病人數(shù)已達(dá)到1.14億[1]。其中2型糖尿病(T2DM)約占糖尿病患者數(shù)的90%[2]。2型糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的發(fā)病因素復(fù)雜的疾病，以葡萄糖耐量降低、胰島素抵抗為主要特征[3]。2型糖尿病作為一種多基因控制的疾病，查找確定易感基因?qū)τ?型糖尿病發(fā)病的研究至關(guān)重要。通過糖尿病動(dòng)物模型篩選易感基因成為研究的重要方法。長爪沙鼠具有獨(dú)特的解剖學(xué)、生理學(xué)特征，對于代謝性疾病具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值[4]。本課題利用自行培育近交系長爪沙鼠2型糖尿病模型材料，通過抑制消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)的方法在糖尿病和正常血糖長爪沙鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)控鈉通道β3亞基基因Scn3b差異表達(dá)。鈉離子通道是一種跨膜蛋白復(fù)合體，包含一個(gè)孔道結(jié)構(gòu)的α亞基和一個(gè)或多個(gè)能夠調(diào)節(jié)通道狀態(tài)且能夠與其他多種蛋白互作的β亞基[5]。其中β3亞基由Scn3b基因編碼，廣泛分布于各種細(xì)胞膜，主要參與心臟電生理活動(dòng)。但是其是否參與糖尿病的發(fā)生目前尚未知曉。因此，本文主要研究Scn3b在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠的肝臟、腎臟、骨骼肌、腦組織和心臟中的表達(dá)情況，為探究長爪沙鼠糖尿病模型致病機(jī)制中Scn3b的作用和靶器官奠定基礎(chǔ)，從而為長爪沙鼠2型糖尿病模型發(fā)生機(jī)制的研究開拓新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取近交系自發(fā)糖尿病長爪沙鼠和對照正常血糖沙鼠，本文中分別用High和Control表示，每組各6只，雌雄各半，12～15周齡。所有長爪沙鼠均來自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，飼養(yǎng)于控制恒溫恒濕的普通環(huán)境中。動(dòng)物自由飲普通水和采食，飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。室溫為(22±2)℃，相對濕度40%～70%，人工光照明暗各12 h。

本實(shí)驗(yàn)中所采用的兩組動(dòng)物的空腹血糖數(shù)值如下：

空腹血糖mmol/L對照組4.9±1.0高血糖組6.7±0.7

糖耐量分別取0 h，0.5 h，1h和2 h的血糖數(shù)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1。

圖1 糖尿病組和正常對照組長爪沙鼠的糖耐量試驗(yàn)

1.2 樣品采集

動(dòng)物施過量麻醉安樂死，解剖采集新鮮糖尿病模型和正常對照長爪沙鼠的肝臟、腎臟、骨骼肌和腦組織，之后立即置于液氮中。

1.3 RNA提取及cDNA制備

從液氮中各取出凍存的長爪沙鼠6種組織約30 mg分別移入均質(zhì)管內(nèi)，加入TRIzol試劑1 mL(Invitrogen，USA)和磁珠，剪碎后用均質(zhì)器將組織徹底打碎，室溫放置1 min，加入200 μL三氯甲烷，混勻靜置15 min，4℃ 14 000 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移上層液體至另一離心管，其中加入500 μL異丙醇，混勻靜置10 min，4℃ 14 000 r/min 離心15 min，棄去上清液。加入70%乙醇900 μL，洗滌沉淀，4℃12 000 r/min 離心10 min，棄去上清液。以上步驟重復(fù)1次。室溫自然干燥，加入適量的RNA-Free水溶解得到總RNA。利用Nanodrop 2 000c(Thermo scientific, USA)分析RNA濃度和純度。

cDNA的制備:利用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)對上述總RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。首先進(jìn)行g(shù)DNA去除反應(yīng)，5×gDNA Buffer 2μL，總RNA，去核酶水補(bǔ)足到10μL，42 ℃孵育3 min。之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，10×Fast RT Buffer 2μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2μL，RT Enzyme Mix 1μL，去核酶水補(bǔ)足到10μL。此配好液體加入此前去除體系中，42 ℃孵育15min，95℃ 3min，得到相應(yīng)的cDNA，-20 ℃保存。

1.4 Real-time PCR

按照SSH得到的Scn3b基因片段序列設(shè)計(jì)引物，利用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物多對。各組織選取Gapdh作為內(nèi)參基因并設(shè)計(jì)引物。引物序列如表1所示，均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

表1 Real-timePCR引物序列

利用Real-time PCR法在Bio-Rad CFX96 manager System上對Scn3b的mRNA水平進(jìn)行檢測。所用試劑為實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(天根)，反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)條件如下: Real-time PCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.6μL，模板cDNA 1μL，RNA-free H2O 7.8μL。反應(yīng)程序均為: 95℃15min，之后95℃ 10 s，60 ℃ 30s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測熒光; 熔解曲線分析從60 ℃到95℃，每0.5 ℃檢測一次。

1.5 Western blotting

取液氮凍存的長爪沙鼠骨骼肌、肝臟、腎臟、脂肪、心臟和腦組織，剪碎后用組織蛋白提取試劑盒(康為世紀(jì))提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-AGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜。以TBS(25 mmol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, pH7.2)含5%脫脂奶粉(CST, USA)和0.05% Tween-20 封閉過夜。將膜與anti-Scn3b抗體(1∶1 000稀釋，abcam, USA)4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，與二抗(辣根過氧化酶聯(lián)的抗兔血清)室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯色。肝臟、腎臟、骨骼肌和腦組織做免疫印跡時(shí)內(nèi)參基因選用Gapdh作為內(nèi)參基因。最后用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)掃描蛋白質(zhì)印跡條帶灰度。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法分析。以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Scn3b基因在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠4種組織中的表達(dá)差異

利用Real-time PCR法分別檢測糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠的肝臟、腎臟、骨骼肌和腦組織Scn3b的mRNA表達(dá)水平。如圖2所示，在肝臟組織中，糖尿病組Scn3b的mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對照組，在骨骼肌和腦組織中，糖尿病組Scn3b的mRNA表達(dá)水平也具有低于正常對照組的趨勢。然而在腎臟中，糖尿病組和對照組間Scn3b的表達(dá)無差異。

2.2 Scn3b蛋白在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠4種組織中的表達(dá)差異

Western Blotting檢測Scn3b蛋白在4種組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示在肝臟中糖尿病組的蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組，與Real-time PCR結(jié)果一致(圖3A)。而在腦組織中，Scn3b糖尿病組的蛋白表達(dá)水平也具有低于對照組的趨勢(圖3D)。然而，在腎臟和骨骼肌中，Scn3b在糖尿病組和對照組則無明顯差異(圖3B-C)。

圖2 Scn3b在糖尿病組和正常對照組長爪沙鼠4種組織中的mRNA表達(dá)水平

3 討論

糖尿病是一組由多種病因引起的，以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，全身多組織和重要器官的功能與代謝都會(huì)受到影響。本研究選取肝臟、腎臟、骨骼肌和腦組織進(jìn)行分析。肝臟作為哺乳動(dòng)物物質(zhì)代謝最主要器官，參與三大類物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化，通過肝糖原合成參與糖類代謝，對糖分調(diào)節(jié)、分布和轉(zhuǎn)化有重要意義，也是胰島素作用的重要靶器官[6]。骨骼肌作為葡萄糖與脂肪酸代謝器官，在胰島素作用下吸收血糖，緩沖血糖變化，對于全身糖代謝有重要意義。腎臟作為糖尿病主要受累器官，糖尿病會(huì)引發(fā)腎臟小血管病變，出現(xiàn)一系列腎臟功能不全的癥狀[6]。同時(shí)糖尿病還會(huì)累及腦組織，腦內(nèi)線粒體利用葡萄糖，代謝產(chǎn)生的活性氧引起組織的氧化應(yīng)激，造成腦組織的病理狀態(tài)[6]。因此我們選取這幾種組織作為研究的切入點(diǎn)。2型糖尿病在糖尿病人群中所占比例最高[7]，其發(fā)病機(jī)制作為近年來的研究重點(diǎn)，其中遺傳因素作為已知的最關(guān)鍵因素之一。所以尋找和確定易感基因成為2型糖尿病發(fā)病研究的關(guān)鍵所在,之后通過SSH從之前定向培育逐步形成的長爪沙鼠自發(fā)糖尿病模型動(dòng)物群體的骨骼肌中，篩選出糖尿病組和正常組長爪沙鼠中的表達(dá)差異基因。本研究挑選出了其中可能與糖尿病和代謝相關(guān)的候選基因Scn3b進(jìn)行不同器官組織表達(dá)分析。

此前有研究發(fā)現(xiàn)敲除α亞基Scn3a或調(diào)節(jié)型亞基Scn1b，能夠減少葡萄糖刺激引起的胰島素分泌[8-9]。因?yàn)橐认佴录?xì)胞是具有電生理活性的，胰島素的釋放依賴于動(dòng)作電位的產(chǎn)生，通過電壓門控鈣離子通道活化,胞內(nèi)鈣離子濃度增加，激發(fā)胰島素囊泡向胞外釋放[10-12]。然而，Scn3b在糖尿病靶組織中的作用卻尚無報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，Scn3b在糖尿病組肝臟和腦組織中mRNA和蛋白水平均下降且與SSH趨勢一致。肝臟參與維持血糖的穩(wěn)定，在胰島素作用下抑制糖原分解，促進(jìn)糖原合成。在糖尿病組動(dòng)物肝臟中Scn3b的mRNA和蛋白水平的顯著下降，提示Scn3b可能參與肝臟血糖分解代謝與糖原合成，其異常降低可能與糖異生異常相關(guān)。腦組織以葡萄糖作為最主要的供能物質(zhì)，作為機(jī)體代謝最旺盛的器官，也是葡萄糖代謝的另一重要場所。糖尿病動(dòng)物腦組織中Scn3b的mRNA和蛋白水平也有一定下降趨勢，我們推測Scn3b可能也與腦組織血糖代謝與利用有關(guān)。以上結(jié)果提示，肝臟和腦組織可能是Scn3b基因參與糖代謝的靶器官。

總之，長爪沙鼠糖尿病模型中Scn3b的表達(dá)變化，顯示出其與糖尿病發(fā)生可能具有相關(guān)性，尤其是在肝臟和腦組織中，這為糖尿病發(fā)病的分子機(jī)制研究以及進(jìn)一步深入研究2型糖尿病的防治提供一個(gè)新的研究角度。