■胡美忠 張新卓 郁建生

（銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁554300）

隨著人們生活水平提升，對綠色安全的動物性食品需求越來越大，安全無抗生素殘留的動物性食品是將來畜牧業(yè)發(fā)展的必然趨勢，發(fā)酵中獸藥，把中藥材和有益微生物有機(jī)結(jié)合起來，近年來在畜牧業(yè)中使用越來越多。發(fā)酵中獸藥在發(fā)酵過程中，菌株代謝產(chǎn)生大量的纖維素酶、蛋白酶等酶制劑，破壞了中獸藥的細(xì)胞壁，使中獸藥的藥效成分充分溶出，提高有效成分的濃度，同時菌株在發(fā)酵過程產(chǎn)生大量活性成分，對動物有利，有益活菌進(jìn)入動物胃腸道后，能維持機(jī)體胃腸道內(nèi)的微生態(tài)菌群的平衡等，調(diào)節(jié)動物機(jī)體整體功能，刺激免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生益生素，產(chǎn)生消化酶等優(yōu)良特性。故發(fā)酵中獸藥有“中獸藥、有益菌、酶制劑、益生素”四合一的特性，有望應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)無抗養(yǎng)殖[1-3]。

中獸藥發(fā)酵，發(fā)酵菌種是關(guān)鍵，中獸藥是重點(diǎn)，兩者正確的搭配才能發(fā)揮中獸藥微生態(tài)制劑的特性。一般是選定可以利用發(fā)酵來提升藥效的中獸藥材，再選擇正確的發(fā)酵菌種，發(fā)酵菌種根據(jù)國家規(guī)定的可直接飼用的微生物目錄，有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌等。選擇單菌發(fā)酵還是復(fù)合菌種發(fā)酵，以及復(fù)合菌種發(fā)酵各菌株之間的關(guān)系對最終微生態(tài)制劑的影響等需要深入研究，本實(shí)驗(yàn)以中獸藥材黃荊子為例，探討了幾種益生菌發(fā)酵黃荊子的特性，以期得到適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵中獸藥黃荊子微生態(tài)制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃荊子

2016年于銅仁市川硐鎮(zhèn)農(nóng)戶手中收購。干燥、粉碎過60目篩備用，黃豆購于當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.1.2 菌種、培養(yǎng)基和試劑

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）S21、產(chǎn)朊假單絲酵母（C.utilis）M22、植物乳桿菌（L.plantarum）T3為本研究室分離篩選鑒定，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 25923）。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L，pH值7.2。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH值自然。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 ml，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸銨2 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 L，pH值（6.2±0.2）。

試劑：均為市售分析純，酶活力檢測所需的試劑根據(jù)文中標(biāo)準(zhǔn)所述配置。

1.1.3 主要儀器

垂直流超凈工作臺（ZHJH-C1214C，上海智城）；pH計（DELTA 320，上海閔勝）；恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9042，上海一恒）；高壓滅菌鍋（HVE-50，北方華粵）。

1.2 方法

1.2.1 黃荊子微生態(tài)制劑制備

固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)配置：稱取黃荊子85 g，黃豆粉7 g、葡萄糖5 g、尿素3 g，加入137.5 ml水?dāng)嚢杈鶆驕缇谩?/p>

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）S21、植物乳桿菌（L.plantarum）T3和產(chǎn)朊假單絲酵母（C.utilis）M22分別使用LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基活化，制備種子液。準(zhǔn)備好的固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)4份，第一份接種12.5 mlB.subtilisS21，第二份接種6 mlB.subtilis S21和6.5 mlC.utilisM22，第三份接種3 mlB.subtilisS21、6.5 mlC.utilisM22和3 mlL.plantarumT3，第四份加入12.5無菌蒸餾水，分別攪拌均勻，置于無菌燒杯（堆積厚度2～3 cm），燒杯口用無菌紗布蒙住，30℃下發(fā)酵72 h。

1.2.2 黃荊子微生態(tài)制劑抑菌活性

稱取發(fā)酵好的黃荊子微生態(tài)制劑10 g，加入10 ml無菌水，震蕩10 min后13 000×g離心得上清液，使用瓊脂擴(kuò)散法測試上清液對金黃色葡萄球菌（S.aureus）的抑制活性。

1.2.3 黃荊子微生態(tài)制劑活菌數(shù)

無菌稱取發(fā)酵好的黃荊子微生態(tài)制劑1 g，加入9 ml無菌生理鹽水稀釋，震蕩1 min后取1 ml按照上述方法繼續(xù)稀釋，得不同稀釋度的樣品，取10-9、10-10和10-11三個梯度樣品涂布PCA平板，37℃培養(yǎng)36 h后計數(shù)。

1.2.4 黃荊子微生態(tài)制劑pH值

稱取發(fā)酵好的黃荊子微生態(tài)制劑5 g，加入5 ml雙蒸水，震蕩5 min后13 000×g離心得上清液，使用pH計測試其pH值。

1.2.5 黃荊子微生態(tài)制劑黃酮含量

黃酮回歸方程制作：精密稱取10 mg蘆?。ㄖ袡z所），轉(zhuǎn)入10 ml容量瓶，加入 60%乙醇超聲輔助溶解，60%乙醇定容至10 ml，搖勻，得1 mg/ml蘆丁母液。分別吸取蘆丁母液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.8 ml于10 ml潔凈容量瓶中，加入3 ml 60%乙醇、0.5 ml 5%NaNO2，混勻后靜置6 min，再加入0.5 ml 10%Al(NO3)3，搖勻后靜置6 min，加入3 ml 4%NaOH，60%的乙醇溶液定容至10 ml，搖勻，得到蘆丁濃度梯度溶液。以不加蘆丁母液的容量瓶為對照，分別測定各容量瓶中蘆丁的OD500值，根據(jù)已知蘆丁濃度和測定的OD500求其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取發(fā)酵好的黃荊子微生態(tài)制劑5 g，加入5 ml蒸餾水，震蕩10 min后13 000×g離心得上清液，取上清液1 ml加入9 ml蒸餾水，測定其OD500值 。根據(jù)回歸方程換算黃荊子微生態(tài)制劑黃酮含量。

1.2.6 黃荊子微生態(tài)制劑蛋白酶活性

蛋白酶含量參考GB/T 23527—2009和SB/T10317—1999蛋白酶活力測定法測定。精確稱取105℃烘干至恒重酪氨酸100 mg，逐步加入6 ml 1 mol/l鹽酸溶解，后用0.2 mol/l鹽酸定容至100 ml，取此液10 ml，以0.2 mol/l鹽酸定容至100 ml，得100 μg/ml的酪氨酸溶液。以100 μg/ml的酪氨酸為母液，用蒸餾水分別配置0、20、40、60、80 μg/ml和100 μg/ml酪氨酸濃度梯度溶液，取6支試管分別吸取上述不同濃度酪氨酸1 ml，各加入0.4 mol碳酸鈉5 ml，再各加入使用蒸餾水稀釋2倍的福林試劑1 ml，搖勻置于水浴鍋中，40℃保溫發(fā)色20 min。分光光度計測定各管OD660值，將各管所測得的 OD660值減去0 μg/ml酪氨酸管的OD660值即得凈OD660值。根據(jù)凈OD660值和酪氨酸濃度求其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取發(fā)酵好的黃荊子微生態(tài)制劑5 g，加入5 ml蒸餾水，在40℃水浴內(nèi)間斷攪拌1 h，9 000×g離心10 min，取上清液1 ml，加9 ml 0.1 mol磷酸鹽緩沖液（pH值7.2）稀釋。取1 ml樣品液，置于40℃水浴2 min，加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1 ml，40℃水浴10 min后，立即加入0.4 mol三氯乙酸2 ml終止反應(yīng)，8 000×g離心8 min得上清液，取1 ml上清液根據(jù)蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法所述的加入0.4 mol碳酸鈉5 ml起，測定其OD660值，空白實(shí)驗(yàn)測定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 ml使酶失活，再加酪蛋白。樣品中1個蛋白酶活力定義為在40℃下1 min水解絡(luò)蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，根據(jù)下述公式計算蛋白酶酶活。

式中：A——樣品測定的OD660值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼幡蘥數(shù)；

N——酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.7 黃荊子微生態(tài)制劑脂肪酶活性

稱取發(fā)酵好的黃荊子微生態(tài)制劑5 g，加入5 ml蒸餾水，震蕩10 min后13 000×g離心得上清液樣品，樣品中脂肪酶活性根據(jù)脂肪酶測試盒（南京建成生物工程研究所）的說明進(jìn)行測定。

企業(yè)價值共創(chuàng)體系的價值創(chuàng)造能力可分為基本價值創(chuàng)造能力和可持續(xù)價值創(chuàng)造能力兩部分。前者對企業(yè)價值共創(chuàng)體系影響很大，是企業(yè)生存能力的綜合體現(xiàn)，后者是企業(yè)價值共創(chuàng)體系的適應(yīng)能力、協(xié)同感知能力、協(xié)同生產(chǎn)能力、未來競爭態(tài)勢預(yù)測能力的綜合體現(xiàn)。

1.2.8 黃荊子微生態(tài)制劑纖維素酶活性

纖維素酶活性根據(jù)NY/T 912—2004飼料添加劑纖維素酶活力的測定分光光度法測定。吸取乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH值5.5）4 ml，加入DNS試劑5 ml，沸水浴5 min，用自來水水浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 ml。得標(biāo)準(zhǔn)空白樣。分別吸取精密配置的葡萄糖溶液（10 mg/ml）1、2、3、4、5、6 ml和7 ml，用乙酸-乙酸鈉緩沖液定容至100 ml。配制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度溶液。吸取上述濃度系列的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2 ml，加入10 ml容量瓶中，再加入2 ml水和5 ml DNS試劑，電磁震蕩3 s，沸水浴加熱5 min，自來水水浴冷卻，再用蒸餾水定容至25 ml。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為對照，測定OD540值。根據(jù)OD540值和葡萄糖濃度求其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取發(fā)酵好的黃荊子微生態(tài)制劑5.000 g，加20 ml乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH值5.5），震蕩10 min用乙酸-乙酸鈉緩沖液定容至100 ml，4℃下避光保藏24 h后搖勻，取30 ml離心機(jī)4 000×g離心，取上清液2.5 ml加乙酸-乙酸鈉緩沖液定容至100 ml稀釋得待測樣品液。吸取2 ml樣品液（先37℃水浴平衡10 min），加入到25 ml容量瓶中，再加入5 ml DNS試劑，超聲3 s，然后加入2 ml羧甲基纖維素鈉溶液（先37℃水浴平衡10 min），37℃水浴30 min，沸水浴加熱5 min，用自來水水浴冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 ml，超聲3 s，以標(biāo)準(zhǔn)空白樣（吸取乙酸-乙酸鈉緩沖液4 ml，加DNS試劑5 ml，沸水浴5 min，用自來水冷卻至室溫，用水定容至25 ml.制成標(biāo)準(zhǔn)空白樣）為對照，在540 nm處測定吸光度AB。另吸取2 ml樣品液（已經(jīng)過37℃平衡10 min），加入到25 ml容量瓶中，加入2 ml羧甲基纖維素鈉溶液（已經(jīng)過37℃平衡10 min），超聲3 s，37 ℃水浴30 min，再加入5 ml DNS試劑，超聲3 s，以終止酶反應(yīng)，沸水浴加熱5 min，用自來水水浴冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 ml。超聲3 s，以標(biāo)準(zhǔn)空白樣（同測AB所述的標(biāo)準(zhǔn)空白樣）為對照，在540 nm處測定吸光度AE。根據(jù)下述公式計算纖維素酶酶活。

式中：XD——纖維素酶活力（U/ml）；

AE——酶反應(yīng)液吸光度；

AB——酶空白樣吸光度；

K——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；

M——等于180.2 g/mol；

t——酶解反應(yīng)時間（min）；

D——稀釋倍數(shù)。

1.2.9 黃荊子微生態(tài)制劑淀粉酶活性

稱取發(fā)酵好的黃荊子微生態(tài)制劑5 g，加入5 ml蒸餾水，震蕩10 min后13 000×g離心得上清液樣品，樣品中淀粉酶活性根據(jù)α-淀粉酶(AMS)測試盒（淀粉-碘比色法）（南京建成生物工程研究所）的說明進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃荊子微生態(tài)制劑抑菌活性

不同益生菌發(fā)酵中獸藥黃荊子所得的微生態(tài)制劑，其水提液表現(xiàn)出不同的抑制金黃色葡萄球菌活性（見圖1）。由圖1可知，不加有益菌發(fā)酵，沒有抑菌活性，使用枯草芽孢桿菌S21發(fā)酵黃荊子，表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制活性，使用枯草芽孢桿菌S21和產(chǎn)朊假單絲酵母M22混合發(fā)酵，抑菌活性強(qiáng)，但是使用枯草芽孢桿菌S21、植物乳桿菌T3和產(chǎn)朊假單絲酵母M22三種菌混合發(fā)酵，其抑菌活性輕微甚至不可辨。

圖1 不同益生菌黃荊子微生態(tài)制劑抑菌活性

黃荊子微生態(tài)制劑表現(xiàn)出抑菌活性，其抑菌物質(zhì)的來源可能有兩個，在這兩者的共同作用下起作用，第一個來源是有益微生物代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，前期的研究發(fā)現(xiàn)的枯草芽孢桿菌S21在會產(chǎn)生多種抗菌脂肽，第二個來源是黃荊子本身的藥效成分有抑菌活性，但是沒有經(jīng)過長時間熬煮不會析出（空白對照組），在有益菌的代謝下，降解了黃荊子的細(xì)胞壁導(dǎo)致其藥效成分析出，故顯示了抑菌活性。使用枯草芽孢桿菌S21、植物乳桿菌T3和產(chǎn)朊假單絲酵母M22三種菌混合發(fā)酵，抑菌活性非常輕微，這可能是枯草芽孢桿菌S21和植物乳桿菌T3兩者相互頡頏，一是影響枯草芽孢桿菌S21代謝產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，二是影響益生菌降解黃荊子細(xì)胞壁析出黃荊子抑菌成分，從而導(dǎo)致抑菌活性散失。說明在生產(chǎn)多菌種微生態(tài)制劑時，一定要注意發(fā)酵菌種之間的相互頡頏關(guān)系。

2.2 黃荊子微生態(tài)制劑活菌數(shù)和pH值

活菌數(shù)是衡量微生態(tài)制劑好壞的一個重要指標(biāo)，pH值可以用來監(jiān)測發(fā)酵過程[4,5]。試驗(yàn)的幾種益生菌發(fā)酵黃荊子活菌數(shù)和pH值見表1，從表1可知，單獨(dú)使用枯草芽孢桿菌S21發(fā)酵，使用枯草芽孢桿菌S21和產(chǎn)朊假單絲酵母M22二菌混合發(fā)酵或者枯草芽孢桿菌S21、植物乳桿菌T3和產(chǎn)朊假單絲酵母M22三種菌混合發(fā)酵，微生態(tài)制劑活菌數(shù)都達(dá)到1012。使用枯草芽孢桿菌S21作為發(fā)酵菌種或者枯草芽孢桿菌S21和產(chǎn)朊假單絲酵母M22混合發(fā)酵，與空白對照組相比其pH值會增加，而使用枯草芽孢桿菌S21、產(chǎn)朊假單絲酵母M22和植物乳桿菌T3混合發(fā)酵，與空白對照組相比其pH值略有下降，究其原因，應(yīng)是植物乳桿菌T3代謝產(chǎn)生乳酸類物質(zhì)，使pH值下降。

表1 不同有益菌黃荊子微生態(tài)制劑活菌數(shù)和pH值

2.3 黃荊子微生態(tài)制劑黃酮含量

發(fā)酵中獸藥有利于中獸藥的有效成分析出[6]。不同益生菌發(fā)酵中獸藥黃荊子所得的微生態(tài)制劑，其黃酮含量變化見圖2，由圖2可知，使用枯草芽孢桿菌S21發(fā)酵，其黃酮含量比空白對照組高出約3倍，而使用枯草芽孢桿菌S21和產(chǎn)朊假單絲酵母M22二菌混合發(fā)酵或者枯草芽孢桿菌S21、植物乳桿菌T3和產(chǎn)朊假單絲酵母M22三種菌混合發(fā)酵，其黃酮含量相對于空白對照也提升1倍以上，可見發(fā)酵能使黃荊子黃酮從細(xì)胞內(nèi)溶出。

黃酮是中獸藥黃荊子的重要有效成分，但是黃酮存在于黃荊子細(xì)胞內(nèi)，由于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的保護(hù)，黃酮從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外比較困難，而通過發(fā)酵，有益菌的代謝會降解黃荊子細(xì)胞壁，有利于黃酮溶出，間接提升了藥效。

圖2 不同益生菌發(fā)酵黃荊子對黃荊子黃酮溶出的影響

2.4 黃荊子微生態(tài)制劑蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶活性

微生態(tài)制劑中各種消化酶能幫助動物消化，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[7-8]。不同益生菌發(fā)酵中獸藥黃荊子所得的微生態(tài)制劑的蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶活性見表2。由表2可知，益生菌發(fā)酵黃荊子的微生態(tài)制劑，枯草芽孢桿菌S21單獨(dú)發(fā)酵，其脂肪酶活性可達(dá)308.4 U/l，蛋白酶活力為51.46 U/mg，纖維素酶為 5.58 U/g，淀粉酶為104.17 U/dl，但是枯草芽孢桿菌S21和產(chǎn)朊假單絲酵母M22二菌混合發(fā)酵或者枯草芽孢桿菌S21、植物乳桿菌T3和產(chǎn)朊假單絲酵母M22三種菌混合發(fā)酵，在各種菌的相互作用下，各種酶的活力會有變化，有增加有降低。

表2 不同有益菌黃荊子微生態(tài)制劑酶活

3 討論

中獸藥發(fā)酵應(yīng)用于動物生產(chǎn)是最近畜牧業(yè)的一個應(yīng)用熱點(diǎn)，發(fā)酵菌種的選擇是中獸藥發(fā)酵關(guān)鍵。發(fā)酵菌種原則上要滿足安全性、穩(wěn)定性、有效性以及生產(chǎn)實(shí)用性等要求。商業(yè)生產(chǎn)菌種應(yīng)是國家批準(zhǔn)的可直接用于飼喂動物的菌種目錄。根據(jù)發(fā)酵菌的菌種數(shù)目可分為單一菌種制劑和復(fù)合菌種制劑兩大類[9]，現(xiàn)在市場上的中獸藥發(fā)酵產(chǎn)品基本上是復(fù)合菌種，常見復(fù)合菌種為芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌、嗜酸乳桿菌。

然而不同的益生菌混合發(fā)酵，因?yàn)橐嫔g有頡頏、共生等不同關(guān)系，必然會對最終的微生態(tài)制劑的效果產(chǎn)生巨大的影響。此研究中，使用枯草芽孢桿菌S21發(fā)酵，微生態(tài)產(chǎn)品表現(xiàn)為強(qiáng)的抑菌活性，但是使用枯草芽孢桿菌S21、植物乳桿菌T3和產(chǎn)朊假單絲酵母M22三種菌混合發(fā)酵，其抑菌活性輕微不可辨，在黃酮含量、各種消化酶的活力等方面，也有顯著變化?？梢姡蝎F藥發(fā)酵菌種的選擇，應(yīng)該根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品的預(yù)期功效來設(shè)計使用，建議優(yōu)先選擇單菌發(fā)酵，如果選擇復(fù)合菌種發(fā)酵中獸藥時，要注意不同菌種的相互作用，這樣才能使發(fā)酵的中獸藥功效最大化。

本項(xiàng)目研究結(jié)果顯示，中獸藥黃荊子發(fā)酵，單獨(dú)選擇枯草芽孢桿菌S21發(fā)酵，其功效綜合起來比使用復(fù)合菌種發(fā)酵要好。