■黃 靈 李小梅 舒 琥* 張海發(fā) 石和榮

(1.廣州大學生命科學學院，廣東廣州510006；2.揭陽市揭東第一中學，廣東揭陽515500；3.廣東省大亞灣海洋漁業(yè)試驗中心，廣東惠州516081）

隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，養(yǎng)殖魚類病害越來越多，為了穩(wěn)產和高產，一些養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用抗生素、禁用化合物及獸藥殘留超標的現(xiàn)象越來越嚴重。因此，急需尋求綠色、生態(tài)并能提高水產動物飼料轉化率和免疫功能的添加劑，從而減少抗生素和化學藥物的使用。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加微生態(tài)制劑可以提高奧尼羅非魚的飼料利用率和抗病力（楊奇慧等，2009），微生態(tài)制劑是在微生態(tài)理論指導下，使用對宿主有益無害的活的一般微生物或促微生物生長的物質，具有快速降解、吸收和轉化養(yǎng)殖環(huán)境中殘餌、糞便、氮和磷等污染物的生物制劑或活菌制劑（齊紅莉等，2004）。微生態(tài)制劑在魚類養(yǎng)殖的報道較多。但有關微生態(tài)制劑在虎龍斑養(yǎng)殖生產應用上的研究鮮有報道，本試驗旨在探討兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑體成分、腸道消化酶和腸道、肝臟及頭腎結構的影響，為開發(fā)新的微生態(tài)制劑及其在虎龍斑生產上的應用提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料及微生態(tài)制劑

試驗飼料包括基礎飼料、乳化魚油包裹飼料（由2%飼料量的乳化魚油包裹基礎飼料）、益生菌飼料（益生菌飼料由基礎飼料與不同用量的益生菌混勻，再以2%飼料用量的乳化魚油包裹制得）。試驗用的基礎飼料由廣東越群飼料公司提供，其詳細營養(yǎng)成分見表1。兩種微生態(tài)制劑分別為芽孢桿菌（Bacillus sp.）制劑和光合細菌(Photosynthesis bacteria)制劑，芽孢桿菌制劑分別由地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和短小芽孢桿菌（B.pumilus）按1∶1比例混合組成，光合細菌制劑是沼澤紅假單胞菌，其中，地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和光合細菌的有效活菌數(shù)分別為1.0×109、2.0×109cfu/g和1.0×109cfu/g。

表1 試驗飼料基本營養(yǎng)成分組成

1.2 試驗魚及飼養(yǎng)管理

試驗用的虎龍斑由廣東省海洋漁業(yè)試驗中心提供，并在該中心進行養(yǎng)殖試驗。選用540尾體質量為（33.98±4.91）g、體長為（10.48±0.61）cm的虎龍斑，隨機分為6個組，每組3個重復，每個重復30尾魚，分別放入18個網箱（1.0 m×1.0 m×1.0 m）內。分別在基礎飼料中添加低濃度0.1%的芽孢桿菌制劑、高濃度0.5%的芽孢桿菌制劑、低濃度1%的光合細菌制劑和高濃度5%的光合細菌制劑，并以2%飼料用量的乳化魚油包裹，配制成編號為Diet 1、Diet 2、Diet 3、Diet 4四種飼料作為添加組，再增設乳化魚油組和對照組。

在整個試驗期間，每20 d測量一次虎龍斑的總重，日投喂率為體質量的3%，日投喂量的多少是由上一次測量魚的總重和其固定的投喂量率一同決定的。每天定量投喂2次，分別于8:30和16:30各投喂一次。整個試驗期間水質如下：平均水溫27～31℃，鹽度25‰～30‰，pH值7.5～8.0，溶氧≥5 mg/l，氨氮≤0.04 mg/l。

1.3 樣品采集

正式飼養(yǎng)60 d，停止投喂24 h后，采集魚的肌肉、腸道保存于-80℃冰箱，用于體成分和消化酶活力分析；另取腸道、肝臟和頭腎在波恩氏液中固定24 h后，更換70%的乙醇保存，用于組織結構分析。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 魚體成分分析

取保存于-80℃的肌肉樣品放到烘干機中干燥至恒重，然后測其常規(guī)成分。粗蛋白質含量采用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量采用索氏抽提儀，以乙醚為抽提液測定；粗灰分含量采用馬弗爐中550℃燃燒失重法測定。

1.4.2 腸道消化酶活力分析

將冰水浴解凍后的腸道稱重，加入9倍體積預冷的生理鹽水，在冰水浴條件下勻漿，然后在4℃、3 000 r/min離心20 min，保留上清液。上清液用于測定腸道胰蛋白酶（Trypsin）、腸道淀粉酶（Amylase）和腸道脂肪酶（Lipase）活力，采用南京建成生物工程研究所生產的相應試劑盒測定，操作步驟按照說明書進行。

1.4.3 組織學結構分析

將固定的虎龍斑幼魚的腸道、肝臟和頭腎經酒精逐級脫水、透明、透蠟、包埋、切片，切片厚度0.5～0.8 μm，HE染色，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 數(shù)據處理及圖像分析

HE染色后每組各取5尾魚的切片，在每張切片中隨機測量5組數(shù)據取平均值作為該切片的數(shù)據，再以5張切片數(shù)據的平均值作為1尾魚組織結構的數(shù)據，然后再取每組5尾魚切片數(shù)據的平均值作為每個試驗組魚組織結構的最后數(shù)據。用SPSS17.0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），若差異顯著，則用Duncan's法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑肌肉體成分的影響(見表2)

表2 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑肌肉體成分的影響(%)

如表2所示，微生態(tài)制劑顯著提高了虎龍斑粗蛋白質含量，所有添加組均顯著高于對照組和乳化魚油組（P＜0.05）?；埌呒∪獯种竞縿t試驗Diet 2組和Diet 3組顯著低于乳化魚油組（P＜0.05），其他各組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。粗灰分含量則乳化魚油組顯著高于對照組和其他各微生態(tài)制劑添加組。

2.2 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑腸道消化酶的影響（見表3）

表3 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑腸道消化酶的影響

如表3所示，微生態(tài)制劑顯著提高了虎龍斑腸道胰蛋白酶活性，所有添加組均顯著高于對照組和乳化魚油組(P＜0.05)。虎龍斑腸道淀粉酶活性則Diet 1組和Diet 3組均顯著高于對照組和乳化魚油組(P＜0.05)，Diet 2組極顯著高于對照組和乳化魚油組(P＜0.01)，而Diet 4組與對照組和乳化魚油組沒有顯著性差異(P＞0.05)。微生態(tài)制劑添加組的虎龍斑腸道脂肪酶活性與對照組和乳化魚油組都沒有顯著差異性(P＞0.05)，而乳化魚油組的脂肪酶活性則顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑腸道組織結構的影響(見表4、圖1)

表4 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑腸道組織結構的影響(μm)

圖1 微生態(tài)制劑對虎龍斑腸道結構的影響（×100）

如表4和圖1所示，試驗虎龍斑腸道組織結構在前腸、中腸和后腸中漿膜層在最外側，腸絨毛高度在最內側，肌層厚度在兩者之間。在前腸的腸絨毛高度中，Diet 2組和Diet 3組顯著高于乳化魚油組（P＜0.05），而在中腸中，Diet 2組的腸絨毛高度顯著高于乳化魚油組（P＜0.05），肌層厚度和漿膜層在前腸、中腸和后腸中各組之間的高度沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑肝臟組織結構的影響

在鮮肝顏色上，各添加組的肝臟顏色都是鮮紅的，而對照組和乳化魚油組的肝臟顏色相對是淺紅的。肝臟組織切片的顯微觀察結果如圖2和表5所示，各組的肝細胞都出現(xiàn)不同程度的脂肪空泡化現(xiàn)象，其中乳化魚油組最嚴重，脂肪空泡化程度分級++，對照組、Diet 1、Diet 2、Diet 3組和Diet 4組的肝細胞脂肪空泡化程度分級+，但從圖2（D）和圖2（E）中可以看出，Diet 2組和Diet 3組效果是較好的，其肝細胞未發(fā)生病變和出現(xiàn)較少的脂肪空泡化現(xiàn)象。在肝臟細胞壞死程度上，乳化魚油組的程度分級++，其肝細胞脂肪變性，排列不規(guī)則紊亂，細胞核被擠壓甚至消失，有的細胞核溶解破裂變性，變性后的肝細胞隨后壞死。對照組、Diet 1組和Diet 4組的程度分級+，其肝組織輕度脂肪變性，肝細胞部分腫脹，排列不整齊，發(fā)生輕度病變與壞死。Diet 2組和Diet 3組的程度分級-，試驗虎龍斑的肝細胞排列整齊而完整，肝細胞索明顯，且肝細胞形態(tài)正常，核大而圓，居中央。

2.5 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑頭腎組織結構及免疫細胞數(shù)量的影響

虎龍斑的頭腎位于心腹隔膜前，呈紅褐色扁平狀，分為左右2葉，在頭腎的基部相連。在心腹隔膜前為頭腎，心腹隔膜后為后腎。由圖3的組織切片觀察，虎龍斑頭腎外覆蓋一層結締組織性的被膜，可見少量的圓形細胞和其它免疫細胞。頭腎是一種網狀結構的淋巴樣實質組織，實質組織無腎單位，主要由淋巴組織和造血組織構成。淋巴組織是由淋巴細胞、中性粒細胞和黑色素巨噬細胞等免疫細胞組成，頭腎組織間分布有動脈血管、靜脈血管和其形成的其它分枝。淋巴細胞在頭腎組織中是數(shù)量最多的細胞，細胞較小，呈圓形或橢圓形；中性粒細胞數(shù)量較少，細胞呈圓形或橢圓形，細胞核較大；黑色素巨噬細胞在頭腎組織中是數(shù)量最少的，其細胞核較大，胞質較少。腎上組織和造血組織分布于淋巴組織間。

如表6所示，微生態(tài)制劑對虎龍斑各組間的頭腎組織細胞總數(shù)沒有顯著差異（P＞0.05）；在淋巴細胞中，Diet 2組顯著高于乳化油組（P＜0.05），其他各組之間均無顯著差異（P＞0.05）；微生態(tài)制劑對虎龍斑頭腎組織的中性粒細胞沒有影響，均無顯著差異（P＞0.05）；微生態(tài)制劑可以顯著增加Diet 2組和Diet 3組的黑色素巨噬細胞，數(shù)量顯著地大于乳化魚油組（P＜0.05），其他各組之間無顯著差異（P＞0.05）

3 討論

3.1 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑肌肉體成分的影響

張雯等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中拌喂微生態(tài)制劑并在養(yǎng)殖水體中施用，可以顯著提高建鯉肌肉的粗蛋白含量，但只在養(yǎng)殖水體中施用微生態(tài)制劑對試驗魚沒有顯著的影響。艾炎軍等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，以芽孢桿菌、光合細菌、EM菌按1∶2∶2和2∶1∶2的比例混合在養(yǎng)殖水體中施用并投喂大鱗副泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）32 d，試驗組泥鰍機體的粗蛋白質含量顯著提高，粗脂肪和灰分含量顯著降低，作者認為可能的原因是，微生態(tài)制劑本身富含各種營養(yǎng)成分，并改善了機體的代謝，提高了機體腸道內的各種消化酶，從而促進了機體營養(yǎng)成分的沉積。在本研究中，相對于乳化魚油組，飼料中添加芽孢桿菌制劑和光合細菌制劑可以提高虎龍斑機體粗蛋白質含量，降低虎龍斑的粗脂肪和灰分含量，與上述研究結果相一致。

3.2 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑腸道消化酶的影響

魚類的消化和吸收能力在其生長中起著重要的作用（Hakim等，2006）。Suzer等(2008)發(fā)現(xiàn)，金頭鯛稚魚攝食益生菌富營養(yǎng)化的生物餌料后，稚魚蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶活力均高于對照組。張雯等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中拌喂微生態(tài)制劑并在養(yǎng)殖水體中施用可以顯著提高建鯉腸道的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。類似的，在本試驗中，各個微生態(tài)制劑添加組的虎龍斑腸道胰蛋白酶和淀粉酶都顯著增加。但光合細菌制劑高濃度組的淀粉酶沒有明顯增加，還有虎龍斑腸道脂肪酶相比對照組和乳化魚油組沒有顯著的影響，這有可能因持續(xù)或過量的添加會抑制內生酶的活性，從而影響了虎龍斑腸道的脂肪酶活性，Tovar-Ramirez等(2004)也發(fā)現(xiàn)了類似的結果。當機體腸道內消化酶活性提高時，機體可以更有效的對飼料中營養(yǎng)物質的吸收，轉化和應用，從而促進了魚類的生長，降低了魚類的飼料系數(shù)。在本研究中，飼料中添加芽孢桿菌制劑和光合細菌制劑可以提高虎龍斑腸道的消化酶，促進虎龍斑的生長，這與相關研究類似（Ziaei-Nejad等，2006；Gullian等，2004）。

圖2 微生態(tài)制劑對虎龍斑肝臟組織結構的影響（×200）

表5 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑肝臟組織結構的影響

3.3 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑腸道組織結構的影響

虎龍斑幼魚的腸道可分為前腸、中腸和后腸，其腸道結構由外到內分為漿膜層、肌層、黏膜下層和黏膜層。在本試驗研究中，虎龍斑幼魚的腸絨毛高度前腸＞中腸＞后腸，肌層厚度后腸＞前腸＞中腸，這與另一種雜交石斑魚（青龍斑）的腸道組織結構相似（李加兒等，2016）。有研究說明，黃鰭鯛（Sparus latus）和駝背鱸（Chromileptes altivelis）的腸絨毛高度從前腸到后腸是逐漸降低（王永翠等，2012；區(qū)又君等，2011），這與本研究結果相同，表明虎龍斑幼魚前腸的營養(yǎng)物質吸收消化能力最強，后腸最弱。

圖3 虎龍斑頭腎組織學結構（×1 000）

表6 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑頭腎免疫細胞數(shù)量的影響(個/張切片)

魚類腸道絨毛高度和密度的多少對其營養(yǎng)物質的吸收和消化是至關重要的，有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加芽孢桿菌可以顯著提高歐洲龍蝦的腸絨毛高度和密度（Daniels等，2010），Pirarat等（2011）研究表明在基礎日糧中添加乳酸菌對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的腸絨毛高度有顯著地影響。此外，在虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）的研究中還發(fā)現(xiàn)，微生態(tài)制劑對試驗魚的腸道組織結構和發(fā)育都有積極的影響（Merrifield等，2010）。在本研究中，飼料中添加芽孢桿菌制劑和光合細菌制劑可以改善虎龍斑幼魚的腸道組織結構，促進了虎龍斑腸絨毛的生長和發(fā)育，保護了虎龍斑腸道組織結構的完整性和穩(wěn)定性，這與羅輝等（2006）在鯉魚（Cyprinus carpio）中的研究結果一致。但微生態(tài)制劑對虎龍斑幼魚腸道組織結構影響的具體原因尚不明確，需要人們進一步對其詳細機理進行研究和評估。

3.4 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑肝臟組織結構的影響

肝臟是魚類身體內以代謝功能為主的一個器官，并在身體里面扮演著氧化，儲存肝糖，解毒等功能。試驗虎龍斑各組都出現(xiàn)不同程度的脂肪空泡化現(xiàn)象，這可能與飼料中的脂肪含量和添加到飼料中的乳化魚油有關，本試驗飼料的粗脂肪含量為10%，有研究表明，當飼料中的脂肪含量高于10%時，美國紅魚(Sciaenops ocellatus)和紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)的肝臟都會出現(xiàn)較嚴重的脂肪空泡化和不同程度的病變現(xiàn)象（李雪菲等，2015；孫陽等，2013），魚肝油乳的成分含有魚肝油，過量的攝食可能是造成脂肪空泡化的原因之一。但也有可能是飼料中存在一些抗營養(yǎng)因子，飼料發(fā)生霉變、污染或者過量投喂等原因。

雷曉中等（2015）研究表明，攝食配合飼料中加蘇丹草和浮萍與直接攝食蘇丹草和浮萍的草魚肝臟組織和細胞形態(tài)結構正常，但只攝食配合飼料的草魚肝細胞發(fā)生了病變與壞死，可能蘇丹草或浮萍中含有一些免疫增強劑，增強了草魚的免疫力，從而減少對草魚肝臟組織的損傷。在本研究發(fā)現(xiàn)，Diet 2組和Diet 3組相對其他試驗組，肝細胞形態(tài)正常，排列整齊，較少出現(xiàn)脂肪空泡化現(xiàn)象，這可能是虎龍斑攝食了芽孢桿菌制劑和光合細菌制劑之后，其自身的免疫力提高，從而減少對虎龍斑肝臟組織的損傷，至于微生態(tài)制劑對魚類肝臟組織結構影響的具體原因還需要進一步的研究。

3.5 兩種微生態(tài)制劑對虎龍斑頭腎組織結構及免疫細胞數(shù)量的影響

在虎龍斑頭腎結構上，分為左右2葉，與徐曉津等（2008）在大黃魚(Pseudosciaena crocea)和 Abdel-Aziz等（2010）在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)中報道的相似。在胚胎時期，魚類的頭腎起源于前腎，具有泌尿功能。但到了成體后，不同種間的魚類，其頭腎結構和功能也有較大的差異，如Safter等（1982）報道在彈涂魚（Periophthalamus koelreuteri）的頭腎中有許多腎單位結構，且與后腎的腎單位較難區(qū)分，而條石鯛（Oplegnathus fasciatus）、駝背鱸（Chromileptes altivelis）、鯔（Mugil cephalus）等大多數(shù)硬骨魚類頭腎無腎單位（胡玲玲等，2010；區(qū)又君等，2015；曹守花等，2013）。在本研究中，虎龍斑的頭腎中無腎單位，其淋巴組織主要由淋巴細胞、中性粒細胞和黑色素巨噬細胞等免疫細胞構成，頭腎組織間還分布著血管等造血組織，說明虎龍斑的頭腎具有免疫和造血功能，與區(qū)又君等（2015）在駝背鱸頭腎的研究中類似。

頭腎免疫細胞是魚類參與免疫應答與反應的重要細胞，影響著魚類的特異性免疫和非特異性免疫功能，從而影響魚類的生長與健康。研究表明，復合微生態(tài)制劑可以顯著提高花鱸（Lateolabrax japonicus)頭腎巨噬細胞數(shù)量和巨噬細胞的殺傷力（吳桂玲等，2007），夏耕等（2012）在飼料中添加抗菌肽和枯草芽孢桿菌可以提高花鱸頭腎的非特異性免疫功能。在本試驗研究中，相比乳化魚油組，高濃度芽孢桿菌制劑組可以顯著提高虎龍斑頭腎的淋巴細胞數(shù)量和黑色素巨噬細胞數(shù)量，低濃度光合細菌制劑組顯著提高了黑色素巨噬細胞數(shù)量。這表明飼料中添加芽孢桿菌制劑和光合細菌制劑在一定程度上可以提高虎龍斑頭腎免疫細胞的數(shù)量，從而提高虎龍斑的免疫力。