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(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

0 引言

近年來(lái)，我國(guó)的飼料抗氧化劑產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，在生產(chǎn)巨大效益的同時(shí)存在一定的安全隱患，極大的威脅著動(dòng)物及人體健康，飼料抗氧化劑的亂用、濫用已成為行業(yè)亟待解決的一大問(wèn)題。在對(duì)飼料抗氧化劑的使用過(guò)程和氧化劑的殘留量進(jìn)行有效監(jiān)察中，氧化劑篩查檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新最為值得我們關(guān)注?？寡趸瘎┰陲暳项I(lǐng)域中被大量的使用，但是人工合成抗氧化劑使用過(guò)量會(huì)進(jìn)入食物鏈，對(duì)人產(chǎn)生毒性。國(guó)家在抗氧化劑的使用方面，有較為嚴(yán)苛的規(guī)定，使用的安全性越來(lái)越受到關(guān)注，而發(fā)展飼料中抗氧化劑的快速檢測(cè)技術(shù)是研究者一直關(guān)注的問(wèn)題樣品的前處理過(guò)程對(duì)于檢測(cè)方法相當(dāng)?shù)闹匾?，直接影響到建立的方法是否能夠獲得良好的準(zhǔn)確性、靈敏性和選擇性。到現(xiàn)在為止，已存在大量關(guān)于飼料樣品前處理技術(shù)和方法的研究，均在不同程度上提高了檢測(cè)方法的靈敏度和選擇性。針對(duì)不同類(lèi)型飼料樣品不同提取和凈化目的，常用的有超聲提取、凝膠滲透色譜、固相萃取、QuECHERS、索振蕩提取等前處理法[1]。

當(dāng)前，人工合成抗氧化劑的檢測(cè)方法主要包括分光光度法、電化學(xué)分析法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等分析方法[2]。雖然分光光度法檢測(cè)成本低，操作簡(jiǎn)單，但是其靈敏度低，很大程度上不能做到痕量分析；而另外一種電化學(xué)分析法靈敏度高、檢測(cè)方便迅速，所以檢測(cè)微量化合物和生物活性成分時(shí)被大量運(yùn)用，但是它測(cè)定的抗氧化劑種類(lèi)十分稀少，成為一種主流的檢測(cè)方法仍具有一定的局限性[3]；薄層色譜法的優(yōu)勢(shì)是在短時(shí)間內(nèi)它可以處理大批規(guī)模樣品，溶劑的使用量較少，損耗減少，儀器易于操作，但是這種方法操作步驟略多，而且無(wú)法同時(shí)檢測(cè)不同的抗氧化劑[4]。對(duì)于飼料中多種人工合成抗氧化劑的同時(shí)定量，當(dāng)前的報(bào)道并不多[5-7]。本文主要對(duì)飼料中抗氧化劑的前處理進(jìn)行了探索，建立多種抗氧化劑同時(shí)檢測(cè)的QuEChERS前處理法-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，對(duì)飼料中不同抗氧化劑的殘留進(jìn)行了分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

儀器ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，Xevo TQMS三重四級(jí)桿質(zhì)譜(美國(guó)Waters公司);CPA225D型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)，KQ-500E臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)Y135型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

Vortex QL - 901渦旋儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，TDZS WS臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，5415 D高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，15 mL (聚四氟乙烯離心管，0.22 μm有機(jī)微孔濾膜。乙酸銨(LC-MS級(jí)，Waters公司)、甲酸(LC-MS級(jí)，Waters公司)、40 μm乙二胺-N丙基硅烷(PSA，天津博納艾杰爾有限公司)、40～60 μm C18吸附劑天津艾杰爾科技有限公司)、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、 (分析純，天津市科密歐公司)、超純水(Millipore超純水機(jī)制備)、微孔濾膜(0. 22 μm，天津津騰公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：乙氧基喹啉(EQ)、沒(méi)食子酸丙酯(PG)、去甲二氫愈創(chuàng)木酚(NDGA)、2,6-二叔丁基-4-甲氧基苯酚(Ionox-100)、沒(méi)食子酸辛酯(OG)、沒(méi)食子酸月桂酯(DG)，純度分別為99.5%，97.5 %，99.0 %，99.5%，97.0 %，98.0 %，購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；2,6-二叔丁基-4-甲氧基苯酚(HMBP)、2,4,5-三羥基苯丁酮(THBP)，純度分別為99.0 %，98.0 %，購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters-C18柱子，色譜柱(Φ1.8 μm，2.1 mm x 50 mm)；柱溫30. 0 ℃，流速0. 2 mL/min；進(jìn)樣量4 μL， 流動(dòng)相A為0.05%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度梯度洗脫： 0～2 min，10%～30 %；2～4 min，維持30% B；4～7 min，30%～70%B；7 ～10 min，維持30% B；10～12 min，30%～10%B。

1.2.2 質(zhì)譜條件參數(shù)

離子化模式：電噴霧電離正離子模式(ESI+)和電噴霧電離負(fù)離子模式(ESI-)，質(zhì)譜掃描模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；脫溶劑氣流： N2，流速800 L /h，脫溶劑溫度 500 ℃；錐孔氣流：N2，流速50 L /h；離子源溫度：150 ℃；碰撞氣體：氬氣，霧化氣壓力0. 28 MPa；碎裂電壓，135 V；毛細(xì)管電壓，3 500 V；MRM定量模式，8種分析物的質(zhì)譜分析條件如表1所示。

表1 抗氧化劑的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、保留時(shí)間和碰撞能量

1.3 樣品預(yù)處理[8-10]

提取稱(chēng)取2.0 g已混勻的飼料樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙睛，用高速均質(zhì)器以4 000 r/min 均質(zhì)30 s在3 000 r/min離心5 min，傾出上清液于250 mL雞心瓶中；重復(fù)提取1次，合并提取液于40 ℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL (高度真空，10 min之內(nèi)完成)，并轉(zhuǎn)移至10 mL刻度離心管中。用少量純乙睛洗雞心瓶，合并于離心管中，濃縮定容至2 mL，加入150 mg C18，3 000 r/min離心5 min，過(guò)0. 45 μm，過(guò)濾后供UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相(乙腈-5 mmol /L 乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸) 的影響。 結(jié)果表明：使用乙腈-0.1%甲酸時(shí)，部分化合物的峰形比較差且存在拖尾現(xiàn)象；當(dāng)改為乙腈-5mmol/L 乙酸銨作流動(dòng)相時(shí)，8種化合物峰形尖銳、信噪比好。

利用標(biāo)準(zhǔn)品使用外標(biāo)法，根據(jù)各抗氧化劑的響應(yīng)情況進(jìn)行上機(jī)條件的優(yōu)化，然后在優(yōu)化后的色譜、質(zhì)譜條件下，檢測(cè)出水產(chǎn)飼料中抗氧化劑殘留情況。根據(jù)所得到的數(shù)據(jù)，以定量離子離子流圖的峰面積( y) 為縱坐標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度(μg /L) 為橫坐標(biāo)，得到各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性回歸系數(shù)。以3倍的信噪比(S/N≥3)來(lái)確定各組分檢出限(LOD)，并試驗(yàn)不同飼料中抗氧化劑的加標(biāo)回收率[11-13]。在線性范圍內(nèi)，得到各類(lèi)被檢測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和檢出限，如表2中所示。

表2 8種抗氧化劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

根據(jù)各目標(biāo)物的響應(yīng)信號(hào)情況及線性范圍，對(duì)8種人工合成抗氧化劑在飼料基質(zhì)中進(jìn)行了各自的低、中、高3個(gè)不同濃度加標(biāo)水平的加標(biāo)，相應(yīng)的平均回收率為76.2%～102.8%，方法符合農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求，如表3中所示。

表3 不同抗氧化劑在飼料基質(zhì)中不同水平的的加標(biāo)回收率

3 實(shí)際樣品檢測(cè)

在優(yōu)化后的色譜、質(zhì)譜條件下，采集了市面上40余種不同類(lèi)型的主要的豬和水產(chǎn)飼料(魚(yú)飼料、蝦、烏龜飼料)，利用建立的方法對(duì)其中的抗氧化劑的殘留情況進(jìn)行了檢測(cè)。總體來(lái)說(shuō)，所采樣的水產(chǎn)飼料中的抗氧化劑的殘留情況總體良好，相比其他的抗氧化劑，EQ、PG、NDGA、 HMBP在飼料中可以檢測(cè)到，其含量情況為乙氧基喹啉(EQ) ，0.18～2.37 mg/kg；去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)，0.03～0.06 mg/kg；2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(HMBP)，0.09～0.13 mg/kg ；沒(méi)食子酸丙酯(PG)0.11～0.13 mg/kg。

4 結(jié)論

試驗(yàn)探索了飼料中人工合成抗氧化劑快速提取方法，建立了對(duì)飼料中多種人工合成抗氧化劑可以同時(shí)、高效、快速檢測(cè)的液-質(zhì)-質(zhì)方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，方便快速，具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，為飼料中人工合成抗氧化劑的快速分析檢測(cè)提供了參考依據(jù)。