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(1.重慶市畜牧科學院，重慶 400015；2.重慶市山羊工程技術研究中心，重慶 榮昌 402460)

0 引言

酉州烏羊烏皮白被毛，獨具特色，具有“藥羊”的美稱，是珍稀的國家級畜禽遺傳資源，但目前資源調查顯示該品種已瀕臨滅絕，急需采取有效的措施來增加種群數(shù)量[1]。人工授精是加速優(yōu)秀種畜繁育的關鍵技術之一。目前筆者的研究團隊已在酉州烏羊配子資源方面進行了一些研究，包括精液保存[2]，卵母細胞體外發(fā)育[3]等，本研究以酉州烏羊羔羊羔羊卵母細胞為材料，研究了3種不同精液的保存方法對羔羊卵母細胞體外受精效果的影響，為挖掘利用這一獨特資源提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 卵母細胞

來自酉州烏羊幼羊體外成熟的卵母細胞。

1.2 精液

來自酉州烏羊資源保護場種公羊。

2 方法

2.1 實驗分組

實驗分為3組，鮮精組、低溫保存組和凍精組，分別為采集的新鮮精液、低溫保存的精液和采用細管法冷凍保存的精液。

2.2 精液采集及處理方法

對同一只酉州烏羊種公羊采用假陰道法獲取精液，鏡下檢測后進行后續(xù)實驗。鮮精組處理方法是根據(jù)密度用精液稀釋液進行3～5倍稀釋后立刻使用；低溫組處理方法是精液稀釋后放到冰箱冷藏室4℃保存過夜，使用時放在水浴鍋中37℃升溫30 s；冷凍組處理方法是從液氮中取出細管凍精立即放入38℃水浴鍋內，升溫15 s。

2.3 精子獲能

先在離心管中39℃水浴鍋中預熱2 mL受精液，然后將200 μL稀釋后的鮮精、低溫保存精液或解凍后凍精用移液器緩慢注入管子底部，靜置30 min收集上清液，然后置于39℃的CO2培養(yǎng)箱中待用。

2.4 體外受精

將體外培養(yǎng)成熟的COCs檢出，置于HSOF操作液中，用移液槍進行吹打脫除部分顆粒細胞和精子，先在HSOF操作液中洗三次，HSOF操作液組成為：HSOF+3 mg/mL BSA，再在受精液中洗3次，受精液組成為：mSOF+10 μg/mL肝素+0.2 μm/L青霉胺+0.1 μm/L亞?；撬?10%EGS。然后移入40 μL的受精液滴中，每個液滴放入15枚左右的成熟COCs，再加入密度為1×106個/mL的獲能精子，置于5%CO2、飽和濕度和38.5℃的CO2培養(yǎng)箱中共孵育18 h。

2.5 胚胎體外發(fā)育

將受精18 h后的卵置于HSOF操作液中，用移液槍吹打脫除精子和顆粒細胞，依次在HSOF操作液、胚胎發(fā)育液中洗滌3次，放入發(fā)育液中，其中每個40 μL的小液滴中移入受精卵15枚左右，然后置于5%CO2、飽和濕度和38.5℃的CO2培養(yǎng)箱體外發(fā)育，培養(yǎng)48 h后進行卵裂情況檢查。

3 結果

檢測鮮精組、凍精組和低溫保存組，IVF后統(tǒng)計各組48 h卵裂率。實驗結果表明冷凍組的卵裂率(42.64%)低于鮮精和低溫保存組，但不同精液保存法的體外受精后卵裂率(42.64%、48.31%、45.13%)差異未達到顯著水平(P>0.05)。(見表1)。

表1 精液不同保存方法對羔羊卵母細胞體外受精效果影響

注:同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

4 討論

酉州烏羊長期以來生長在封閉的環(huán)境中，以放牧為主,飼養(yǎng)管理相對粗放，主要通過自然交配的方式進行繁殖。酉州烏羊新鮮精液的采集使用經(jīng)常受到時間地點的限制，在夏季及冬季山羊乏情季節(jié)不能保證采集精液的質量，另外資源保護場與實驗室相隔也較遠，前期本研究團隊對酉州烏羊種公羊的精液品質特性和生產水平進行了鑒定和評估[2], 后續(xù)實驗制作了酉州烏羊細管凍精[4],通過冷凍等方法，積極探索酉州烏羊種質資源的利用途徑。

陳曉勇[5]比較了精液保存方法對羔綿羊卵母細胞體外受精效果影響，結果表明鮮精組卵裂率顯著性高于低溫保存和冷凍保存精液組(P<0.05),與本研究結果有所差異。本實驗研究結果表明凍精組卵裂率低于新鮮精液組和低溫保存的精液組，可能是由于精液經(jīng)過冷凍解凍處理后，影響了精子受精能力，但不同保存方法受精效果未達到顯著水平，說明可以在實際工作中可以嘗試對酉州烏羊細管凍精進行一些探索利用。