萬志佳,陳石磊,劉文果△(.沙坪壩區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心檢驗(yàn)科,重慶 400030;.陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院防原醫(yī)學(xué)教研室,重慶 400038)
抑郁癥是嚴(yán)重危害人類健康的常見精神疾病,其發(fā)病的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)分泌系統(tǒng)功能異常在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用[1-2]。近年研究表明,下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能亢進(jìn)與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。微小RNA(miRNA)是一類長約22 bp的內(nèi)源性非編碼小RNA,可調(diào)控約30%的細(xì)胞內(nèi)基因,與心血管病、糖尿病、腫瘤、精神疾病等的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[5-6]。miRNA可能在抑郁癥患者的HPA軸功能亢進(jìn)中發(fā)揮重要作用[7-8]。本研究分析了抑郁癥患者血清miR-18a與HPA軸功能亢進(jìn)的相關(guān)性,旨在為抑郁癥診療提供新的思路。
1.1 一般資料 于2015年4月至2017年4月確診的抑郁癥患者50例納入抑郁癥組,男27例、女23例,年齡 21~48 歲,平均(31.8±7.5)歲,病程 3~15個(gè)月,平均(8.3±5.1)個(gè)月,符合《中國精神疾病分類方案及診斷標(biāo)準(zhǔn)(第2版修訂本)》情感性精神障礙抑郁發(fā)作診斷標(biāo)準(zhǔn),其中單相31例,雙相19例。同期體檢健康者50例納入對照組,男27例、女23例,年齡20~50歲,平均(32.5±8.3)歲。兩組研究對象年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
1.2 方法
1.2.1 血液樣本處理 采集所有研究對象靜脈血,4℃條件下2 000 r/min離心10 min,收集血清,液氮保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 血清miR-18a測定 (1)miRNA的提取和純化:采用mirVana PARIS Kit(美國Ambion公司)試劑盒提取和純化miRNA。取血清樣品500 μL,室溫下加入等體積變性液,立即充分混勻后加入等體積酸性酚氯仿,渦旋震蕩 30~60 s;室溫下 14 000 r/min離心 5 min。取上清液于新管中,加入1.25倍體積的無水乙醇,充分混勻后加入到柱子中,12 000 r/min離心30 s,棄濾液;向柱子中加入 700 μL 洗液 1,12 000 r/min 離心 30 s,棄濾液;向柱子中加入500 μL洗液2/3,12 000 r/min離心30 s,棄濾液;重復(fù)用500 μL洗液2/3洗滌1次,棄濾液后12 000 r/min離心1 min;加入60 μL 95℃預(yù)熱洗脫液到柱子中,12 000 r/min 離心 1 min,收集 miRNA。(2)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增:采用TaqMan?MicroRNA Revers Transcription Kit試劑盒將提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按說明書操作。miR-18a逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:16℃30 min,42℃ 30 min,85℃ 5 min。miR-18a逆轉(zhuǎn)錄引物序列:5′-CTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACG CCA A-3′,上游引物序列:5′-GAT AGC AGC ACA GAA ATA TTG GC-3′,下游引物序列:5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。U6 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃ 30 min,85℃ 5 min。U6逆轉(zhuǎn)錄引物序列:5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA ATA T-3′,上游引物序列:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,下游引物序列:5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。(3)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增:采用Maxima SYBRGreen qPCR Kit試劑盒(美國賽默飛公司),按試劑盒說明書操作。結(jié)果采用比較閾值法計(jì)算,即:目的基因的量=2-△△Ct,△△Ct=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct值-實(shí)驗(yàn)組管家基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組管家基因Ct值)。
1.2.3 血清指標(biāo)檢測 采用放射免疫法檢測血清標(biāo)本促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)酮(CORT)水平。檢測試劑購自南京建成生物試劑研究所。按試劑盒說明書操作。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,相關(guān)性分析采用Pearson分析。P<0.05為比較差異和統(tǒng)計(jì)參數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 血清miR-18a表達(dá)水平檢測 抑郁癥組血清miR-18a表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)(P<0.01),見圖1。
圖1 抑郁癥組與對照組血清miR-18a表達(dá)水平
2.2 血清CRH、ACTH、CORT水平檢測 抑郁癥組血清CRH、CTH、CORT表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)(P<0.05),見表1。
表1 抑郁癥組與對照組血清CRH、ACTH、CORT水平比較(±s,n=50)
表1 抑郁癥組與對照組血清CRH、ACTH、CORT水平比較(±s,n=50)
注:與對照組比較,aP<0.05
組別抑郁癥組對照組CORT(μg/L)216.53±63.25a 124.56±35.22 CRH(ng/L)9.41±2.46a 5.98±1.49 ACTH(ng/L)21.38±6.54a 13.76±4.05
2.3 抑郁癥患者血清miR-18a與CRH、ACTH、CORT相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,抑郁癥患者血清miR-18a與血清CRH、ACTH、CORT水平呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.89、0.73、0.81,P值分別為0.006、0.024、0.013。
抑郁癥是由多種因素引起的情感障礙性疾病,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征,是心境障礙的主要類型,臨床可見心境低落與其處境不相稱,情緒的消沉可以從悶悶不樂、悲痛欲絕、自卑抑郁到悲觀厭世,可有自殺企圖和行為,甚至發(fā)生木僵;部分患者有明顯的焦慮和運(yùn)動性激越,嚴(yán)重者可出現(xiàn)幻覺、妄想等精神病癥狀,每次發(fā)作持續(xù)至少2周以上,長者甚至數(shù)年;多數(shù)患者有反復(fù)發(fā)作的傾向,每次發(fā)作大多數(shù)可以緩解,部分可有殘留癥狀或轉(zhuǎn)為慢性。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全闡明,相關(guān)學(xué)說包括炎癥學(xué)說、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體學(xué)說、HPA軸功能失調(diào)學(xué)說、神經(jīng)營養(yǎng)因子學(xué)說等[9]。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能改變,特別是HPA軸功能的改變可能在抑郁癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要部分,參與控制應(yīng)激反應(yīng),并調(diào)節(jié)許多身體活動,如消化、免疫反應(yīng)、心情和情緒、性行為,以及能量儲存和消耗等。HPA軸功能亢進(jìn)被認(rèn)為是抑郁癥重要的病理生理變化。本研究比較了健康者與抑郁癥患者血清CRH、ACTH、CORT水平,發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清CRH、ACTH、CORT水平顯著上升,提示抑郁癥患者HPA軸功能亢進(jìn)。
miRNA是一類長約22 bp的非編碼單鏈小分子RNA,其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因,而幾個(gè)miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因,例如單個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá),多個(gè)miRNA聯(lián)合作用,對某個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。miRNA可作用于相應(yīng)靶基因miRNA,在神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡等多種生命活動中發(fā)揮調(diào)控作用。多種miRNA可能參與了抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展。SMALHEISER等[10]對自殺身亡的抑郁癥患者和非抑郁癥死亡者后腦組織前額葉皮質(zhì)中miRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者21種miRNA表達(dá)水平明顯降低。UCHIDA等[11]研究發(fā)現(xiàn),在母嬰分離大鼠前額葉中受抑制元素l-沉默轉(zhuǎn)錄因子4(REST4)調(diào)節(jié)的miRNA表達(dá)水平顯著增高。本研究比較了健康者與抑郁癥患者血清miR-18a表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清miR-18a水平顯著上升,提示miR-18a可能參與了抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展。
對HPA軸的調(diào)節(jié)主要依賴于糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR)。GR和MR是保守的核受體超家族成員,屬于核轉(zhuǎn)錄因子,被激活后通過與核內(nèi)靶基因上的一段特定DNA序列結(jié)合,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮各種生物效應(yīng)。MR參與基礎(chǔ)水平HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié),介導(dǎo)HPA軸基礎(chǔ)活性的維持;而在機(jī)體做出“戰(zhàn)斗或逃跑”反應(yīng)時(shí),GR主要參與應(yīng)激狀態(tài)下的高水平糖皮質(zhì)激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié),抑制HPA軸過度激活,或使功能亢進(jìn)的HPA軸恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。MR/GR的平衡對HPA軸功能活性具有關(guān)鍵調(diào)控作用。抑郁癥患者GR數(shù)量和功能均低于健康者[12],而GR是miR-18a的靶基因,miR-18a表達(dá)上調(diào)可抑制GR表達(dá)[13]。本研究中的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,抑郁癥患者血清miR-18a表達(dá)水平與郁癥患者HPA軸功能亢進(jìn)呈顯著正相關(guān),其機(jī)制可能在于抑郁癥患者miR-18a表達(dá)水平升高,抑制GR表達(dá)和功能,破壞MR/GR平衡,最終導(dǎo)致HPA軸的過度激活。
綜上所述,抑郁癥患者miR-18a表達(dá)水平顯著升高,且其表達(dá)水平與HPA軸功能亢進(jìn)密切相關(guān),說明miR-18a有望成為抑郁癥診斷及病情判斷的分子標(biāo)志物,值得進(jìn)一步深入研究。