曹 興，張秀省，侯 棟，隋娟娟，穆紅梅，高祥斌，呂福堂，郭尚敬，王桂清，*

(1.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070；3.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037)

百合(Liliumspp.)為百合科百合屬球根花卉，具有重要的觀賞、食藥用價值。百合灰霉病是百合的主要病害之一，主要為害百合的葉、莖和花，導(dǎo)致葉片枯死、花器褐腐、莖稈發(fā)黑和鱗莖停止生長，嚴(yán)重影響百合的產(chǎn)量和質(zhì)量，制約了百合商品化周年生產(chǎn)[1]。培育抗病品種是防治灰霉病的有效途徑，而解析百合與病原菌互作的分子機制是百合灰霉病抗性遺傳改良的基礎(chǔ)。植物多蛋白橋梁因子(multiprotein bridging factor 1，MBF1)又稱轉(zhuǎn)錄輔激活因子(transcriptional co-activator)，可以連接通用轉(zhuǎn)錄因子TBP(TATA-box binding protein)和基因特異性轉(zhuǎn)錄因子，從而增強特異性轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，最終促進靶基因的表達[2]，如WRKY、CBF、MAPK3/11和鈣結(jié)合蛋白等。研究表明，MBF1參與了植物的病原真菌脅迫反應(yīng)。小麥TaMBF1a[3]、擬南芥AtMBF1a[4]、馬鈴薯StMBF1[5]的表達均受真菌侵染誘導(dǎo)，擬南芥過表達AtMBF1a的轉(zhuǎn)基因植株，提高了對灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)的抗性[4]。

目前，關(guān)于百合MBF1的研究尚未見報道。我們從麝香百合(Liliumlongiflorum)成熟花粉EST數(shù)據(jù)庫中篩選了一個MBF1同源基因LlMBF1a，分析了該基因的表達模式及該蛋白的特征，以期為進一步研究LlMBF1a基因在百合灰霉病抗性反應(yīng)中的功能及作用機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為麝香百合雜種系(Liliumlongiflorumhybrids)品種白天堂(White Heaven)和粉紅珍珠(Pink Pearl)，栽培基質(zhì)為蛭石+草炭(體積比1∶1)，培養(yǎng)溫度為22 ℃，光照時間為16 h·d-1。亞細胞定位使用的材料為本氏煙(Nicotianabenthamiana)。百合灰霉病病原物灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)由本實驗室分離、純化并保存。

RNA提取試劑盒、大腸埃希菌感受態(tài)DH5α購自北京天根生化科技有限公司；DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶(SalⅠ、SpeⅠ、SmaⅠ)、熒光定量試劑盒SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)等購自TaKaRa公司；氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)購自Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)；DNA測序由北京六合華大基因科技有限公司完成；亞細胞定位載體pCAMBIA1300由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點實驗室惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1LlMBF1acDNA序列的克隆

取0.1 g白天堂葉片用液氮研磨提取RNA。RNA的提取和cDNA的合成參照隋娟娟等[6]的方法。根據(jù)NCBI上已報道的擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtMBF1a的mRNA序列，利用BLAST程序搜索與其高度相似的百合表達序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)。然后將該序列(BP176978)在NCBI上進行同源比對，用ORF Finder程序預(yù)測其開放閱讀框(open reading frame，ORF)。在起始密碼子上游設(shè)計特異引物SPF1，在終止密碼子下游設(shè)計特異引物SPR1，使用保真性較高的PrimeSTAR?HS DNA聚合酶進行ORF全長校正，PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 50 s，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將預(yù)期大小的條帶切膠回收，連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，經(jīng)Amp抗性篩選和菌落PCR檢測，將含有目的基因片段的陽性克隆送公司測序。

1.2.2 LlMBF1a的生物信息學(xué)分析

用Primer Premier 5軟件將目的基因的ORF序列翻譯成氨基酸序列；用EXPASY (https://www.expasy.org/tools/)中的ProtParam、SMART、SignalP、TMHMM、PSORT等工具對LlMBF1a進行生物信息學(xué)分析；用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST功能和DNAMAN 5軟件對LlMBF1a進行多重比對分析；用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 LlMBF1a的亞細胞定位

利用DNAMAN 5分析LlMBF1a的ORF序列的酶切位點，結(jié)合pCAMBIA1300載體，選用SalⅠ和SpeⅠ作為融合表達載體構(gòu)建的酶切位點，并設(shè)計上游特異引物SPF2和下游特異引物SPR2進行PCR擴增。雙酶切pCAMBIA1300空載質(zhì)粒和PCR擴增產(chǎn)物，純化酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，獲得pCAMBIA1300-LlMBF1a-GFP重組表達載體，雙酶切和測序驗證連接是否成功。將構(gòu)建好的載體利用冰融法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，然后用農(nóng)桿菌侵染煙草的方法[7]將構(gòu)建好的pCAMBIA1300-LlMBF1a-GFP重組表達載體注射到煙草的下表皮，空載pCAMBIA1300-GFP作為對照。暗培養(yǎng)1 d和光培養(yǎng)2 d后，用激光共聚焦顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-E)觀察和拍照，并用Zeiss LSM Image Browser軟件對照片進行分析和處理。

1.2.4LlMBF1a的表達分析

選擇生長良好、長勢一致的相對抗病品種白天堂和相對感病品種粉紅珍珠作為基因表達分析的材料。

LlMBF1a在不同組織中的表達：分別取常溫(22 ℃)培養(yǎng)的白天堂的根、莖、鱗莖和葉片，用液氮速凍并保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

LlMBF1a受灰葡萄孢菌侵染的表達：將灰葡萄孢菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)上培養(yǎng)10 d，溫度25 ℃。用含有0.1% Tween 80的無菌水配成1×106mL-1的孢子懸浮液。采用噴霧法接種于白天堂和粉紅珍珠植株上，22 ℃保濕培養(yǎng)。分別在0、12、24、48、96 h取植株中部相近葉位葉片，用液氮速凍并保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR)的方法檢測基因的表達，LlMBF1a的擴增引物為qF1和qR1，內(nèi)參基因18S rRNA的擴增引物為18SqF和18SqR。參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑盒說明書進行，儀器為Applied Biosystems Step One Plus System PCR儀。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。采用2-ΔΔCT方法[8]分析基因的相對表達量，用Excel軟件分析數(shù)據(jù)。

表1 逆轉(zhuǎn)錄和PCR引物

表中下劃線表示酶切位點。

Underline represented the restriction enzyme cutting site.

2 結(jié)果與分析

2.1 百合LlMBF1a的ORF克隆

獲得目的基因ORF區(qū)序列長為429 bp，編碼142個氨基酸(圖1)。BLAST的結(jié)果顯示，該基因與其他物種的MBF1a基因序列有較高的一致性，暫將其命名為LlMBF1a。

2.2 百合LlMBF1a的生物信息學(xué)分析

ProtParam在線工具預(yù)測百合LlMBF1a蛋白包含142個氨基酸殘基，分子式為C672H1152N204O209S3，分子量為15.53 ku。親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.713(<0)，屬于親水蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為35.10(<40)，屬于穩(wěn)定蛋白，理論等電點(pI)為10.12，屬于堿性蛋白。蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測程序SignalP預(yù)測分值為0.106(<0.5)，表明LlMBF1a不含信號肽，不屬于分泌蛋白。蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測軟件TMHMM未發(fā)現(xiàn)LlMBF1a有明顯的跨膜區(qū)域，蛋白質(zhì)亞細胞定位工具PSORT預(yù)測LlMBF1a主要定位于細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)。將LlMBF1a氨基酸序列與其他植物的MBF1a進行同源比對，利用SMART工具分析結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明LlMBF1a在靠近N端9～79位氨基酸殘基形成1個典型的MBF1結(jié)構(gòu)域(MBF1 domain)，在靠近C端86～141位氨基酸殘基形成1個α螺旋-轉(zhuǎn)角-α螺旋模序(helix-turn-helix motif，HTH motif)(圖2)。

采用MEGA 5將百合LlMBF1a和其他植物的MBF1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示MBF1家族有2個分枝，第Ⅰ類MBF1(group Ⅰ)包括a亞型(subtype a)與b亞型(subtype b)；c亞型(subtype c)與a、b亞型相似度較低，歸屬第Ⅱ類MBF1(group Ⅱ)。百合LlMBF1a歸屬于Ⅰ類a亞型，與同為單子葉植物的大葉藻(Zosteramarina)的親緣關(guān)系最近(圖3)，BLAST顯示相似度達89%。特征結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化分析的結(jié)果進一步說明本研究分離得到的LlMBF1a屬于植物MBF1a的同源基因。

圖1 百合LlMBF1a基因開放閱讀框及編碼的氨基酸序列Fig.1 Open reading frame of LlMBF1a and predicted amino acid sequences

2.3 百合LlMBF1a亞細胞定位

利用農(nóng)桿菌侵染煙草的方法將pCAMBIA1300-LlMBF1a-GFP重組表達載體注射到煙草的下表皮，暗培養(yǎng)1 d和光培養(yǎng)2 d后放置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，空載對照pCAMBIA1300-GFP的綠色熒光分布在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中。pCAMBIA1300-LlMBF1a-GFP的綠色熒光主要分布在細胞核內(nèi)(圖4)，表明LlMBF1a主要在細胞核中表達。

2.4 百合LlMBF1a的表達分析

利用實時熒光定量PCR檢測了LlMBF1a的表達模式。結(jié)果表明，常溫(22 ℃)條件下，LlMBF1a在百合根、莖、葉和鱗莖中均有表達，表達量無顯著差異(圖5-A)?；移咸焰呔秩鞠鄬共∑贩N白天堂后，LlMBF1a的表達量顯著上升，在24 h達到峰值，是對照的6.00倍，之后有所下降，但仍顯著高于對照；灰葡萄孢菌侵染相對感病品種粉紅珍珠后，LlMBF1a的表達量顯著上升，在12 h達到峰值，是對照的4.36倍，之后表達量逐漸下降，96 h時的表達量已經(jīng)與對照相近(圖5-B)。結(jié)果表明，LlMBF1a的表達受灰葡萄孢菌脅迫誘導(dǎo)，在相對抗病品種中持續(xù)高水平表達，說明LlMBF1a可能參與了百合對灰葡萄孢菌的防御反應(yīng)。

圖中節(jié)點上的數(shù)值表示bootstrap驗證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點可信度的百分比(%)。The number at the nodes of the figure represented the reliability percent (%) of bootstraps values based on 1 000 replications.圖3 百合MBF1a與其他物種MBF1家族系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic relationship of LlMBF1a with other plant MBF1s

圖4 LlMBF1a在煙草表皮中的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of LlMBF1a in N.benthamiana epidermal cells

3 討論

百合灰霉病是百合的主要病害之一，病原物為橢圓葡萄孢菌(Botrytiselliptica)[9]。我們從北京地區(qū)溫室栽培的感染灰霉病的東方百合雜種系索邦植株中，首次分離鑒定了病原物灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)，該病原菌也能侵染麝香百合雜種系白天堂[10]。前期對百合灰霉病的研究多集中在病害發(fā)生規(guī)律及綜合防治[1]、殺菌劑篩選[11-12]和抗病種質(zhì)資源[13-14]等方面，而百合與病原菌互作的分子機制正成為近年的研究熱點。百合絲裂原活化蛋白酶MAPK基因與灰霉病抗性有關(guān)[15]。超表達岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因LrGLP2增強了煙草對灰葡萄孢的抗性[16]。對小麥、擬南芥等的研究表明，MBF1參與了植物對病原真菌的防御反應(yīng)。根據(jù)氨基酸序列的不同，植物中的MBF1可分為a、b、c三個亞型，a亞型與b亞型相似度較高，歸屬第Ⅰ類MBF1；c亞型與a、b亞型相似度較低，歸屬第Ⅱ類MBF1[17]。本研究利用電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù)從百合中分離了MBF1a基因，序列比對及系統(tǒng)進化分析顯示，LlMBF1a歸屬Ⅰ類a亞型MBF1，具有典型的MBF1和HTH模序。生物信息學(xué)預(yù)測LlMBF1a主要定位于細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，進一步的亞細胞定位結(jié)果證實了LlMBF1a主要在細胞核中表達，這與對TaMBF1a[3]、AtMBF1a[18]的研究結(jié)果一致。

A，LlMBF1a在不同組織中的表達；B，LlMBF1a受灰葡萄孢菌侵染后的表達。A，The expression of LlMBF1a in different tissues; B，The expression of LlMBF1a in leaf at different post inoculation time points.圖5 LlMBF1a的表達模式Fig.5 Expression pattern of LlMBF1a in lily

組織表達模式研究表明，LlMBF1a在不同組織中表達量相當(dāng)，這與TaMBF1a[3]和AtMBF1b[17]的組織表達模式相似。TaMBF1a[3]、陸地棉GhMBF1[19]、AtMBF1a[4]、StMBF1[5]的表達均受真菌侵染誘導(dǎo)。番茄LeMBF1可能通過激活部分PRs基因的表達來提高植株的抗病性[20]。擬南芥過表達AtMBF1a的轉(zhuǎn)基因植株，增強了對灰葡萄孢菌的抗性[4]。在灰葡萄孢菌侵染早期，LlMBF1a的表達顯著上調(diào)。與相對感病品種粉紅珍珠相比，LlMBF1a在相對抗病品種白天堂中持續(xù)高水平表達，說明LlMBF1a可能參與了百合對灰葡萄孢菌的防御反應(yīng)，但是需要進一步通過過表達和沉默方法[21]分析LlMBF1a在百合抗灰霉病方面的功能。