胡 紅 李子南 鄭 珊 敬海明 馮 穎 尤育洲 李國(guó)君 寧鈞宇，2

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心/北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013)(2. 首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069)

毒理學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)，其主要研究手段是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，旨在將外源化學(xué)物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)結(jié)果外推至人，以期評(píng)價(jià)外源化學(xué)物對(duì)人的危害，為確定安全限值和采取防治措施提供科學(xué)依據(jù)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，大量基因修飾動(dòng)物越來越多地應(yīng)用到毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中。與野生型動(dòng)物相比，基因修飾動(dòng)物中特定基因的表達(dá)強(qiáng)度改變或功能喪失，可以加速某些疾病的進(jìn)程(如腫瘤)，縮短毒理學(xué)試驗(yàn)周期，有助于降低毒理學(xué)評(píng)價(jià)的成本。此外，“有害結(jié)局路徑(Adverse outcome pathway)”概念的提出將毒理學(xué)研究深入到基因、分子層面，而基因修飾動(dòng)物的出現(xiàn)為探討毒物對(duì)機(jī)體的損傷機(jī)制提供了便利。

基因修飾動(dòng)物包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲除動(dòng)物以及基因敲入動(dòng)物，在基因敲除動(dòng)物中，應(yīng)用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)將基因敲除局限于特定組織、細(xì)胞或時(shí)間進(jìn)程中，便可獲得條件性基因敲除(conditional knock-out, cKO)動(dòng)物。相對(duì)于傳統(tǒng)的完全性基因敲除(conventional knockout)動(dòng)物，條件性敲除能使基因在時(shí)間和空間上的靶位修飾更加明確、精準(zhǔn)，效果更加可靠。因此，cKO能避免傳統(tǒng)基因敲除動(dòng)物的不足而用于具有胚胎致死性目的基因的研究，并用于研究基因在特定的組織或細(xì)胞中的生理病理功能。隨著DNA同源重組與胚胎干細(xì)胞等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，條件性基因敲除技術(shù)日趨成熟，cKO動(dòng)物模型大量出現(xiàn)，同時(shí)也為科學(xué)研究提供了更加廣闊的平臺(tái)。

鑒于條件性基因敲除動(dòng)物具有如此優(yōu)越性，在本文中我們主要闡述其原理和發(fā)展現(xiàn)狀，以及在毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀和今后可能的發(fā)展方向。

1 條件性基因敲除動(dòng)物的原理和發(fā)展現(xiàn)狀

胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)是成功制作cKO動(dòng)物的重要基礎(chǔ)。1981年，英國(guó)科學(xué)家Evans和Kaufman提取出了小鼠的胚胎干細(xì)胞[1]。在此基礎(chǔ)上，1994年Gu等利用Cre-Loxp系統(tǒng)對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行改造，完成了第一例條件性基因敲除的研究[2]。時(shí)至今日，條件性基因敲除動(dòng)物制備技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成熟，其主要步驟可簡(jiǎn)述如下(圖1)[3]：①打靶載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建。②打靶載體導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES)，并篩選發(fā)生同源重組的陽性ES克隆。③ES顯微注射和嵌合胚胎制備，并與Cre工具鼠雜交。④F1代的繁殖和鑒定。

圖1 條件性基因敲除動(dòng)物制備簡(jiǎn)述

目前，條件性基因敲除小鼠技術(shù)日趨成熟，并廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)[4]、臨床醫(yī)學(xué)(心臟病、肝病、糖尿病)[5-8]以及毒理學(xué)(神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)[9-11])等領(lǐng)域，為這些領(lǐng)域提供了一個(gè)全新、強(qiáng)有力的研究手段。

與小鼠相比，大鼠在神經(jīng)系統(tǒng)、代謝方式等方面與人類更為接近，且由于個(gè)體比較大使得其在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中更容易進(jìn)行手術(shù)等操作，所以在神經(jīng)系統(tǒng)、代謝方式的研究上是更理想的動(dòng)物模型[12]。雖然具備以上優(yōu)勢(shì)，但一直未能找到建立大鼠胚胎干細(xì)胞株的方式[13]，直到2008年，Li等才第一次成功地從大鼠胚胎中提取出胚胎干細(xì)胞，這是除小鼠外第二種動(dòng)物建立的胚胎干細(xì)胞株[14]。Abbott曾在報(bào)道中預(yù)言，在不久的未來大鼠將會(huì)代替小鼠重新成為實(shí)驗(yàn)室里的重要研究對(duì)象[15]。隨后，在2010年Tong又首次培育出了腫瘤抑制基因p53基因敲除的大鼠[16]。這一系列的突破使科學(xué)家利用大鼠作為動(dòng)物模型、研究人類疾病的愿望有了實(shí)現(xiàn)的可能。由于測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)的巨大進(jìn)步，以及大鼠胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)及基因敲除技術(shù)的逐步成熟，如今，各種類型的條件性基因敲除大鼠也已廣泛應(yīng)用于科研各領(lǐng)域[17]。目前實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除的動(dòng)物還有斑馬魚[18]、秀麗隱桿線蟲[19]。

2 條件性基因敲除動(dòng)物在毒理學(xué)中的應(yīng)用

2.1 外源化學(xué)物致癌作用研究

與傳統(tǒng)的致癌實(shí)驗(yàn)相比，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因敲除動(dòng)物的誘癌實(shí)驗(yàn)一般在3個(gè)月左右就可以完成，這些基因突變模型不僅縮短腫瘤的潛伏期，還可增加腫瘤發(fā)生率[20]，因此更加省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)。無疑，基因改造的動(dòng)物模型在毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)中有很高的應(yīng)用價(jià)值，但是在推廣應(yīng)用前還需要進(jìn)行系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化并逐步完善評(píng)價(jià)體系。目前條件性基因敲除動(dòng)物主要應(yīng)用于致癌機(jī)制研究，以明確基因在癌癥形成過程中的作用機(jī)制。

芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)主要功能是與外源性芳香烴結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)，是介導(dǎo)多種環(huán)境污染物反應(yīng)的配體轉(zhuǎn)錄因子，比如2,3,7,8-四氯代二苯-并-對(duì)二噁英(2,3,7,8-TCDD)、苯并a芘(Benzoapyrene, BaP)。2,3,7,8-四氯代二苯-并-對(duì)二噁英(2,3,7,8-TCDD)是迄今為止人類已知的毒性最強(qiáng)的污染物，國(guó)際癌癥研究中心已將其列為人類一級(jí)致癌物。為了深入探討AhR的生理作用和建立危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)的有效模型，Schmidt等利用同源重組建立了AhR的全基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)AhR-/-小鼠出現(xiàn)了不同程度的肝損害，這說明AhR在維持肝的正常生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要作用[21]。根據(jù)Boutros等的研究，AhR自身就影響肝臟392個(gè)基因的表達(dá)[22]。經(jīng)過TCDD處理后，在野生型和AhR敲除小鼠中有471個(gè)AhR依賴而非TCDD依賴的轉(zhuǎn)錄水平變化基因[22]。Cornelis J. Elferink等在條件性敲除小鼠肝臟AhR中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的特異性內(nèi)源性AhR信號(hào)通路靶基因Stanniocalcin 2 (Stc2)[23]。因?yàn)椴溉閯?dòng)物的Stc2是一種對(duì)非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)和凋亡具有保護(hù)作用的分泌性糖蛋白[24]，所以認(rèn)為AhR調(diào)節(jié)的Stc2對(duì)肝細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。并且Elferink等還發(fā)現(xiàn)TCDD能導(dǎo)致AhR與Cyp1a1啟動(dòng)子結(jié)合而不能與Stc2結(jié)合[23]，進(jìn)一步深化了TCDD的肝臟毒性機(jī)制研究。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究對(duì)于鑒別人類化學(xué)致癌物發(fā)揮重要作用，盡管目前建立了很多小鼠靶基因突變模型來針對(duì)性地分析特定組織的腫瘤生長(zhǎng)情況，但是仍沒有用來確定化合物潛在致癌性的模型系統(tǒng)。今后仍需建立不同的癌變模型，用以研究致癌物對(duì)特定組織的致癌作用。

2.2 發(fā)育毒性研究

根據(jù)Wilson致畸學(xué)基本原理，孕體對(duì)致畸因素的易感性依賴于孕體的基因型及其孕體與致畸因素相互作用的方式。在對(duì)化合物生殖毒性評(píng)價(jià)中，通過條件性基因敲除，可對(duì)胚胎致死性基因(如：重組人金屬蛋白酶10、PTEN、brca1/2等)的表達(dá)進(jìn)行時(shí)空特異性控制，以避免出現(xiàn)死胎，并對(duì)其它基因相關(guān)聯(lián)的發(fā)育毒性進(jìn)行機(jī)制研究。

1960—1962年間沙利度胺作為抗妊娠反應(yīng)藥物應(yīng)用于臨床后，出現(xiàn)8 000例海豹畸形兒，表現(xiàn)為四肢短缺陷、無眼、顎裂、骨骼發(fā)育不全、十二指腸和肛門閉鎖等，利用cKO動(dòng)物可更加清晰認(rèn)識(shí)其發(fā)育毒性的機(jī)制。Bashur等通過Jab1的cKO小鼠和微團(tuán)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：Jab1是體內(nèi)早期胚胎肢發(fā)育所必須的調(diào)節(jié)因子，它可能通過“共激活”Y染色體“男性性別決定區(qū)族蛋白9”(SRY (Sex determining region Y)-box 9，Sox9)和BMP信號(hào)來起作用[25]。Notch信號(hào)通路是高度保守的，它對(duì)許多組織器官的發(fā)育都起著關(guān)鍵作用。電離輻射所導(dǎo)致的骨損傷可能是由于Notch1-4四種受體介導(dǎo)的信號(hào)通路[26]。Nantie等利用早期胚胎條件性Notch2敲除發(fā)現(xiàn)，Notch2的缺失對(duì)早期胚胎垂體的增殖影響不大，但是對(duì)產(chǎn)后孕體的維持和增殖至關(guān)重要，并且發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)對(duì)胚胎期和出生后的Prop1表達(dá)是必須的[27]?？傮w來講，cKO動(dòng)物在發(fā)育毒性領(lǐng)域的應(yīng)用還比較少，經(jīng)典動(dòng)物仍是篩選發(fā)育毒性的主流，但相關(guān)cKO動(dòng)物能揭示產(chǎn)生發(fā)育毒性的機(jī)制，并能最終減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推的不確定性，具有一定的應(yīng)用前景。在發(fā)育毒性應(yīng)用的基礎(chǔ)上，cKO動(dòng)物也為化學(xué)致突變性的研究提供了有希望的動(dòng)物模型。

2.3 毒理基因組學(xué)研究

毒理基因組學(xué)是研究生物體的整個(gè)基因組如何對(duì)環(huán)境有害因素發(fā)生反應(yīng)的一門新興學(xué)科。它利用人類基因組的資料，幫助篩選和鑒別潛在的環(huán)境毒物，并在基因組水平上闡明毒作用發(fā)生的機(jī)制。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF/c-Met)在肝再生中的肝細(xì)胞存活和組織重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。在對(duì)肝臟Met條件性基因敲除的小鼠進(jìn)行慢性CCl4染毒后，c-Met cKO小鼠更加容易發(fā)生肝損害并發(fā)展成肝纖維化。采用芯片平臺(tái)對(duì)小鼠的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組(基因的RNA表達(dá))進(jìn)行檢測(cè)，這可在全基因組的范圍內(nèi)篩選出顯著改變的基因。然后用免疫蛋白印跡技術(shù)(Western Blot，WB)驗(yàn)證入選的與肝纖維化相關(guān)的關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平，總轉(zhuǎn)錄組分析揭示了c-Met(Met proto-oncogene，c-Met)在與肝纖維化關(guān)鍵信號(hào)通路中的廣泛影響：趨化和炎性信號(hào)分子(MCP-1, RANTES, CXCL10)的下調(diào)以及其它相關(guān)基因的變化如細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)(Actb,Tuba1a,Tuba8)、細(xì)胞間交流和粘附(Adam8,Icam1,Itgb2)、細(xì)胞增殖(Ccng2,Csnk2a,Cdc6,cdk10)以及DNA損傷和應(yīng)激反應(yīng)(Rad9, Rad52, Ercc4, Gsta1 and 2, Jun)[28]。

毒理基因組學(xué)的近期目標(biāo)是確定全基因組中對(duì)某種有害因素產(chǎn)生應(yīng)答的基因(信號(hào)分子的基因)，用于有害結(jié)局路徑的毒理學(xué)和相關(guān)疾病的研究；遠(yuǎn)期目標(biāo)是建立全基因組與蛋白質(zhì)組毒性反應(yīng)知識(shí)庫，開辟數(shù)字毒理學(xué)。cKO動(dòng)物的出現(xiàn)將極大豐富毒理學(xué)反應(yīng)知識(shí)庫。

2.4 藥物的藥效及安全性評(píng)價(jià)

在抗腫瘤藥物的研究中，可利用cKO動(dòng)物對(duì)抗腫瘤藥物進(jìn)行危險(xiǎn)性分析，評(píng)價(jià)藥物的安全性。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)是人類突變率最頻繁的腫瘤抑制基因之一。而PTEN雙等位基因敲除的胚胎致死性阻礙了PTEN完全敲除在癌癥研究中的應(yīng)用。在cKO的技術(shù)成熟條件下，Mirantes等條件性敲除上皮細(xì)胞內(nèi)PTEN分子，小鼠能很快生成子宮內(nèi)膜腺瘤、前列腺上皮內(nèi)瘤樣病變、甲狀腺增生；他們?cè)賹⒁谰S莫司連續(xù)給予15 d，每天10 μg/g體質(zhì)量施加于這些小鼠，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜增生和甲狀腺增生得到抑制[29]。前列腺上皮條件性敲除PTEN能導(dǎo)致前列腺上皮內(nèi)瘤，Hafeez等利用此模型研究發(fā)現(xiàn)口服白花丹素0.2 mg/g或者0.5 mg/g能抑制前列腺癌的發(fā)展，并且在第15周和30周時(shí)均沒有毒性指征[30]。cKO動(dòng)物模型的出現(xiàn)為PTEN缺失的腫瘤的抗腫瘤藥物研究提供了很好的疾病模型。cKO動(dòng)物為基因治療提供了更具體的動(dòng)物模型，并為新的基因靶點(diǎn)提供更可靠的證據(jù)。

這些以cKO動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的劑量-反應(yīng)關(guān)系模型不僅整合了分子/生化反應(yīng)、細(xì)胞/組織反應(yīng)，還提供了發(fā)育毒性測(cè)定的靶組織劑量的藥物動(dòng)力學(xué)信息，并揭示其分子機(jī)制。

3 結(jié)語

現(xiàn)有研究報(bào)導(dǎo)在條件性基因敲除的小鼠中，重組酶誘導(dǎo)劑多西環(huán)素不僅刪除目的基因，還影響免疫系統(tǒng)，降低回腸中Il1b, Il10, Il18，Tnf, Cxcl1, Cxcl2的表達(dá)以及結(jié)腸中Il18的表達(dá)[31]，盡管這有可能使得研究結(jié)果的解釋復(fù)雜化，但條件性基因敲除技術(shù)日趨成熟，cKO動(dòng)物模型也為科學(xué)研究提供了更加廣闊的平臺(tái)，目前cKO動(dòng)物的制作與發(fā)展應(yīng)用日新月異[32-34]。國(guó)際基因敲除小鼠協(xié)作體(International Knockout Mouse Consortium)的一項(xiàng)新技術(shù)——高通量打靶技術(shù)，將基因工程鼠的批量生產(chǎn)成為可能，每個(gè)月能產(chǎn)生數(shù)以百計(jì)的基因敲除胚胎干細(xì)胞[35]。在許多復(fù)雜疾病方面，如心血管和精神疾病，大鼠在建立疾病模型過程中操作更加簡(jiǎn)單，因此要比小鼠更有優(yōu)勢(shì)。隨著研究的深入，生物學(xué)者通過從整體水平到細(xì)胞、分子水平的機(jī)制研究之后得到了大量數(shù)據(jù)，并建立假說，這些假說急需回到動(dòng)物整體水平加以驗(yàn)證，條件性基因敲除動(dòng)物的出現(xiàn)給該需求提供了實(shí)驗(yàn)的條件。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，毒理學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用cKO動(dòng)物作為研究對(duì)象還不多，但近兩年有增加趨勢(shì)。隨著描述性毒理工作的完善，機(jī)制性毒理學(xué)研究的深入，更多的條件性基因敲除的動(dòng)物將會(huì)應(yīng)用于毒理學(xué)研究領(lǐng)域中，這將給未來的系統(tǒng)化、整體化、綜合化的毒理學(xué)研究趨勢(shì)提供可能。