張思博，趙 陽(yáng)，李 杰，李 斌，羅建成

(南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽(yáng) 473004)

月季花(Chinese Rose)別名有月月紅、四季花。原產(chǎn)于我國(guó)，素有“花中皇后”的美譽(yù)。根據(jù)醫(yī)藥及藥草類古籍中對(duì)月季花的記載，月季花的花瓣和花根經(jīng)研磨后可入藥，歸肝經(jīng)，其性味為甘，溫?？梢曰钛{(diào)經(jīng)，疏肝解郁。月季花中的紅色素是一類天然植物色素類活性物質(zhì)，主要為花青素。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花色素可以降低血液的粘稠度，疏通血管，改善血液循環(huán)，促進(jìn)人眼視網(wǎng)膜細(xì)胞中的視紫質(zhì)的再生成從而達(dá)到預(yù)防近視增強(qiáng)視力的作用;花青素可以穩(wěn)定大腦組織，使大腦不受有害物質(zhì)的傷害;花青素具有清除自由基的作用，從而讓癌細(xì)胞無(wú)法順利擴(kuò)散，所以可以避免更多健康的細(xì)胞被癌細(xì)胞所侵蝕。因此，以花青素作為功能性成分的藥物對(duì)于癌癥的治療有著很好的積極作用［1］。色素類化合物的提取方法有:針對(duì)脂溶性色素用有機(jī)溶劑提取法，常使用的有機(jī)提取溶劑有乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、石油醚、乙酸乙酯等;利用植物體內(nèi)生物多種活性物質(zhì)與堿的不同作用常用堿提取法［2］;超臨界二氧化碳流體萃取方法是一種新型針對(duì)物質(zhì)分離、精制技術(shù)，使用這種方法所得到的產(chǎn)品沒(méi)有毒性、沒(méi)有溶劑殘留，不僅經(jīng)濟(jì)還是一種環(huán)境友好型的萃取技術(shù)［3］。利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、極高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑，可以提高提取率，并且不存在溫度對(duì)該技術(shù)的影響［4－7］。飽含天然色素類化合物的月季花，是開(kāi)發(fā)天然抗氧化活性物質(zhì)的天然金庫(kù)。該研究課題可為大規(guī)模生產(chǎn)天然色素類活性物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，至今未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

月季花花瓣(采摘于河南南陽(yáng)理工學(xué)院藥用植物園)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FW－100高速萬(wàn)能粉碎機(jī):北京中興偉業(yè)儀器有限公司;HHS－6電熱恒溫水浴鍋:上海躍進(jìn)儀器有限公司;101－2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司;721 N可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精752N紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;SCIENTZ－ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):上海珂淮儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

花青素(紅色素)標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇(AR)、乙醇(AR)、乙醚(AR)、石油醚(AR)、乙酸乙酯(AR)、正丙醇(AR)、正丁醇(AR)，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

1.4 月季花紅色素提取工藝

月季花花瓣清洗→干燥→粉碎→水浴提取→超聲處理提取→離心→定容→稀釋→測(cè)定含量。

1.5 月季花紅色素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取花青素標(biāo)準(zhǔn)品0.6500g，使用95%濃度的乙醇溶液于25mL容量瓶中進(jìn)行定容，得到濃度為0.026g/mL的紅色素標(biāo)準(zhǔn)液，精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 的紅色素標(biāo)準(zhǔn)液分別于七個(gè)潔凈的10mL容量瓶中，然后用95%乙醇溶液于10mL容量瓶中進(jìn)行定容，充分振蕩后靜置10min，在可見(jiàn)分光光度儀上520nm處測(cè)吸光度值，繪制曲線。

1.6 樣品的測(cè)定及提取率的計(jì)算

1.6.1 樣品測(cè)定方法［8－12］

將月季花色素提取液離心處理，使用50mL容量瓶對(duì)提取液進(jìn)行定容，用移液管精確吸取定容溶液10mL于刻度試管中，再使用移液管于刻度試管中精確吸取溶液1.0mL于10mL刻度試管中，稀釋10倍，最后用95%乙醇溶液于10mL容量瓶中進(jìn)行定容，充分振蕩后靜置10min，在可見(jiàn)分光光度儀520nm處測(cè)吸光度值。

1.6.2 色素提取率的計(jì)算

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以推導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:x=(y+0.0066)/0.0507

y:吸光度值。

x:計(jì)算得到的色素提取物的濃度。

提取率=(色素提取物的濃度×提取液體積)/月季花花瓣粉末的重量×100%

在吸光度測(cè)量時(shí)將提取液稀釋10倍，則推導(dǎo)出月季花紅色素含量的計(jì)算公式為:

色素含量(g/100g)=(色素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮重(或干重)

即:η%=(x×1 mL×10)/1000/1 g×100(g/100 g)

2 結(jié)果與分析

2.1 色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

不同濃度的色素標(biāo)準(zhǔn)液在520nm處測(cè)吸光度值如圖1所示。

圖1 不同濃度色素標(biāo)準(zhǔn)品在520 nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)圖1中數(shù)據(jù)計(jì)算月季花中紅色素含量與色素吸光度值之間的線性關(guān)系:y=0.0507x－0.0066。其中 y代表于520 nm處測(cè)得的吸光度值;x為色素濃度(mg/mL)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9976，回歸極顯著。所以在色素含量為0～16 mg/mL的范圍內(nèi)，是可以用該方法檢測(cè)色素含量的。

2.2 提取溶劑對(duì)色素提取率的影響

精確稱量7份月季花花瓣粉末，每份1.0g，分別甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、石油醚、乙醚、乙酸乙酯為溶劑;在料液比為1∶50(g/mL)，80℃的水浴提取1h，超聲波功率450W，占空比1/2(超聲中超聲時(shí)間與總時(shí)間的比值)處理15min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶。每種溶劑做3個(gè)平行試驗(yàn)，求平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 不同溶劑的色素提取率

由表1中數(shù)據(jù)可以看出，不同的提取溶劑色素的提取率有所不同，由上表可知乙醇的提取率最大，故以下實(shí)驗(yàn)均選擇乙醇溶劑作為提取溶劑。

2.3 提取溶劑濃度對(duì)色素提取率的影響

精確稱量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用乙醇作為提取溶劑，分別用50%、60%、70%、80%、95%、無(wú)水乙醇提取。料液比為1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1h，超聲波功率450W，占空比1/2處理15min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶。不同濃度提取溶劑做3個(gè)平行試驗(yàn)，求平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 不同濃度提取溶劑的色素提取率

由表2中數(shù)據(jù)可以看出，提取溶劑的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)影響是比較明顯的，在95%乙醇提取溶劑濃度下獲得最大色素提取率。

2.4 提取水浴溫度對(duì)色素提取率的影響

表3 不同水浴溫度的色素提取率

精確稱量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇為提取溶劑，按料液比 1∶50(g/mL)，采用 20、40、60、80、100℃提取溫度提取1h，超聲波功率450W、占空比1/2處理15min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同水浴溫度做3個(gè)平行試驗(yàn)，求平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

由表3中數(shù)據(jù)可以看出，隨著溫度的升高色素提取率隨之升高，超過(guò)80℃之后反而下降，分析原因有可能是色素分子的結(jié)構(gòu)在高溫下受到了破壞。故選擇80℃水浴溫度作為最佳提取水浴溫度。

2.5 提取溶液的料液比對(duì)色素提取率的影響

精確稱量5份月季花花瓣粉末，每份1.0 g，使用95%乙醇為提取溶劑，80℃水浴提取 1 h，分別采用 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60料液比，超聲波功率450W，占空比1/2處理15min，提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同料液比做3個(gè)平行試驗(yàn)，求平均值，結(jié)果如表4所示。

表4 不同料液比的色素提取率

由表4中數(shù)據(jù)可以看出，物料與提取溶劑的配比越大越好，隨著料液比的增大色素提取率也隨之增大，但是在料液比為1∶50之后有下降趨勢(shì)，在考量實(shí)驗(yàn)成本與實(shí)驗(yàn)效果等因素的基礎(chǔ)上選擇料液比為1∶50為提取實(shí)驗(yàn)最佳料液比。

2.6 超聲波功率對(duì)色素提取率的影響

精確稱量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1h。放入超聲波儀器處理，分別采用在 150、300、450、600、750W 和占空比為1/2的條件下提取20min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同超聲波功率做3個(gè)平行試驗(yàn)，求平均值，結(jié)果如表5所示。

表5 超聲波功率對(duì)色素提取率的影響

由表5中數(shù)據(jù)可以看出，超聲波功率對(duì)色素提取率的影響不是超聲波功率越大越好，而是存在最優(yōu)水平即450W超聲波功率，故選擇450W超聲波功率為色素提取最優(yōu)水平。

2.7 超聲波占空比對(duì)色素提取率的影響

表6 超聲波占空比對(duì)色素提取率的影響

精確稱量7份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1 h。放入超聲波儀器提取，在功率為450W，占空比為1提取10min、2/3提取15min、1/2 提取 20min、1/3 提取 40min、1/4 提取 50min。提取液離心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同超聲波占空比做3個(gè)平行試驗(yàn)，求平均值，結(jié)果如表6所示。

由表6中數(shù)據(jù)分析可以看出，超聲波占空比為1/2時(shí)色素提取率有最大值，所以選擇超聲波功率為1/2為超聲波處理提取的最優(yōu)水平。

2.8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù) Box－Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［13－14］，綜合單因素實(shí)驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取3個(gè)對(duì)色素提取率影響顯著的因素，將乙醇濃度、水浴溫度和超聲波功率3個(gè)對(duì)色素提取率影響顯著的因素，確定乙醇濃度95%、料液比為1∶50，超聲波占空比為1/2，分別以A、B和 C為代表，每一個(gè)自變量的試驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼。0代表最優(yōu)水平、－1為最優(yōu)水平左面的水平、1為最優(yōu)水平右面水平。以月季花紅色素提取率為響應(yīng)值(Y)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表7，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析如表。

表7 響應(yīng)面分析因素與水平

其中，對(duì)提取溶劑乙醇溶劑濃度A、水浴提取時(shí)間B和超聲波提取功率C作變換公式如下:A=(Z－95)/5，B=(t－80)/20，C=(T －450)/150(Z、t、T 分別為試驗(yàn)提取溶劑乙醇溶劑濃度、水浴提取溫度及超聲波提取功率)以 A、B、C為自變量，以3次試驗(yàn)所得月季花紅色素提取率的平均值為響應(yīng)值(Y)，結(jié)果見(jiàn)表8。其中1～12為析因試驗(yàn)，13～15是中心復(fù)合試驗(yàn)，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表8 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

采用Minitab 15質(zhì)量數(shù)據(jù)分析電腦軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合，將以上數(shù)據(jù)錄入進(jìn)行分析后，得到回歸方程和提取率估計(jì)回歸系數(shù)表如表9:

Y=11.9320 － 0.349000A+0.0367500B+0.215250C －0.698250A2 － 0.476750B2 － 0.802250C2+0.204000A*B+0.335500A*C+0.298000B*C。S=0.309198，PRESS=6.66798，R －Sq=93.36% ＞90.00%，說(shuō)明方法可靠。R － Sq(預(yù)測(cè))=7.35%R －Sq(調(diào)整)=81.40%。

表9 提取率的估計(jì)回歸系數(shù)

由表9提取率的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可以得知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ?(1)一次項(xiàng)A乙醇濃度顯著;(2)二次項(xiàng)A2極顯著，B2、C2顯著;(3)交互項(xiàng)都不顯著。

提取率方差分析結(jié)果如表10，提取率的估計(jì)回歸系數(shù)，使用未編碼單位的數(shù)據(jù)結(jié)果如表11。

表10 提取率的方差分析

表11 提取率的估計(jì)回歸系數(shù)，使用未編碼單位的數(shù)據(jù)

以下為保持其中一個(gè)因素不作變化的情況下，探究其余兩個(gè)因素對(duì)色素提取率的影響，使用曲面圖形及等值線圖形來(lái)直觀地表達(dá)了每一因素對(duì)響應(yīng)值即色素提取率的影響，如圖2～7所示。

圖2 色素提取率與乙醇濃度，水浴溫度曲面圖

圖3 色素提取率與乙醇濃度，水浴溫度等值線圖

圖4 色素提取率與乙醇濃度，超聲功率曲面圖

圖5 色素提取率乙醇濃度，超聲功率等值線圖

圖6 色素提取率與水浴溫度，超聲功率曲面圖

圖7 色素提取率與提取時(shí)間，提取溫度等值線圖

對(duì)分析所得的回歸方程:

Y=11.9320 － 0.349000A+0.0367500B+0.215250C －0.698250A2 － 0.476750B2 － 0.802250C2+0.204000A*B+0.335500A*C+0.298000B*C

求一階偏導(dǎo)并聯(lián)立方程組，解得A=－0.225500885，B=0.0185651718，C=0.0904499059，代入前面的變換公式可得到乙醇濃度Z為96.1% 、水浴提取溫度t為80.4℃、超聲波功率為463.6W。即月季花中紅色素提取工藝最佳工藝條件為，采用乙醇濃度為96.1%、水浴提取溫度80.4℃、料液比1∶50、超聲波處理提取超聲波功率463.6W、超聲波占空比為1/2。對(duì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證得到提取率為12.94%。

3 結(jié)論

在采用有機(jī)溶劑萃取、超聲波輔助處理提取工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究中，得到最佳工藝條件為乙醇濃度為96.1%、提取溫度80.4℃、料液比 1∶50、超聲波處理提取超聲波功率 463.6W、超聲波占空比為1/2。對(duì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證得到提取率為12.94%。