孫好芬，王 露，高玉璽，劉 宇，趙炳彥

(青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，山東青島266033)

在水質(zhì)評價中，生化需氧量是目前衡量水質(zhì)有機(jī)污染常用的重要指標(biāo)。目前廣泛應(yīng)用的BOD5測定方法是標(biāo)準(zhǔn)稀釋法［1］，操作復(fù)雜、耗時耗力，不利于大批量樣品的分析。而對于庫侖滴定法、差壓法、活性污泥法和相關(guān)計算法等［2－3］，前兩種方法也不能縮短時間，后兩種方法又有較大的局限性，因此也不能滿足實(shí)際要求，且不能及時反映排放水的污染程度，因而無法進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)控。由此，實(shí)際工作中迫切需要一種操作簡單、準(zhǔn)確快速、自動化程度高、應(yīng)用范圍廣的新方法測定BOD，智能型BOD快速測定儀就是在此迫切要求下產(chǎn)生的一種集微生物學(xué)與現(xiàn)代電子技術(shù)于一體的高新技術(shù)產(chǎn)品。國內(nèi)外已有文獻(xiàn)［4－5］報導(dǎo)，日、美、英、德等國家已有商品化的生物傳感器快速測定儀，且日本已制定了有關(guān)生物傳感器測定BOD的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［6］。我國已在2009年《水質(zhì)·生化需氧量BOD的測定(HJ05－2009)》一文中也已明確規(guī)定使用微生物傳感器快速測定法。所以，將快速生物傳感器監(jiān)測技術(shù)和方法引入環(huán)境水處理領(lǐng)域，將多學(xué)科的最新技術(shù)進(jìn)行交叉組合，開發(fā)新型的水質(zhì)分析和廢水處理過程的監(jiān)測儀器是一個必然的發(fā)展趨勢。

1 實(shí)驗(yàn)材料與微生物傳感器的制備

1.1 菌種

采用具有高效單一菌種(自行分離、培養(yǎng)、提純，未鑒定)。

1.2 試劑

(2)BOD標(biāo)液:中國環(huán)境監(jiān)測總站－－將葡萄糖和谷氨酸各150mg溶解并定容至100 mL，其BOD值為(2000±370)mg/L。

1.3 儀器

LY－07型BOD智能生物檢測儀;恒溫生化培養(yǎng)箱;恒溫( ±0.1℃)搖床;離心機(jī)。

1.4 微生物膜的制備

1.4.1 菌種的培養(yǎng)

取青島某藥廠廢水，充分振蕩、靜置，取少量富含高效菌種的上清液接種于培養(yǎng)基中，在(37±1)℃條件下振蕩培養(yǎng)48h，冷卻，再以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，得到濕菌體。用0.9%的NaCl液清洗2次，分離，再接種到100 mL的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，得到乳白色濕菌體后置于冰箱中4℃保存，備用。

1.4.2 微生物膜的制備

所選擇的微生物敏感材料是對污水中有機(jī)物有較強(qiáng)分解代謝能力的微生物，在保持微生物活性的前提下，取一定量的濕菌體與一定量的聚乙烯醇溶液混合，均勻地涂在0.45μm的濾膜上，并加以固定，構(gòu)成固定化微生物膜。

1.5 微生物膜的活化

微生物膜保存于0～4℃條件下，使用前用蒸餾水清洗后安裝在電極上，浸泡于緩沖溶液中1～2d，加入適量BOD標(biāo)準(zhǔn)溶液，開機(jī)活化1d。

1.6 儀器工作參數(shù)

測量時長為15min;BOD標(biāo)液:(2000±370)mg/L。

而夏天，聽著外面猛烈的雨聲，心里漸漸感覺到了局促，什么時候才可以走呢？外面有沒有公交車？即使有公交車，這個遙遠(yuǎn)而陌生的地方，他能夠順利地回去嗎？曉曉是他心目中的女神，這是他和她單獨(dú)相處的第一個晚上，他不能冒犯她，他不能唐突她，如果不走，他可以做到嗎？

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 微生物的篩選

目前國內(nèi)外研制的BOD傳感器多用單一菌種［7－10］:丁酸梭菌、假單孢菌［7］、異常漢遜氏酵母菌［8］、皮狀絲孢酵母菌［9］、芽孢桿菌［10］等，與我們自行培養(yǎng)的高效菌種相比較，結(jié)果表明:經(jīng)特殊水質(zhì)的廢水分離、提取，然后再次培養(yǎng)的微生物(未經(jīng)鑒定)純度和活性較高，壽命長，通用性也較強(qiáng)，可以測定生活污水和某農(nóng)藥、化工廢水的BOD值，并且使用時間長達(dá)12個月，具有前述菌種所無法比擬的優(yōu)越性。而采取長期馴化菌種廢水［11］接種獲得的微生物菌種，測定結(jié)果重復(fù)性不高，精密度差，主要原因可能是由于馴化廢水中菌類的種類和數(shù)量不穩(wěn)定，微生物分布不均勻。

2.2 生物膜的制備

細(xì)胞固定化最常用的方法是包埋。利用凝膠包埋、樹脂吸附固定以及交聯(lián)等固定化技術(shù)進(jìn)行比較［12］，確定以吸附包埋固定化技術(shù)比較適宜于器材的大批量生產(chǎn)，并且測定線性范圍較廣。將已培養(yǎng)成功的微生物固定在聚乙烯醇凝膠中，再用超濾膜制成片狀微生物薄膜。此薄膜在常溫條件下包埋，機(jī)械強(qiáng)度、韌性、透氣性均交好，且易于更換，使用方便、快速。

2.3 微生物膜的使用壽命

由文獻(xiàn)［13－14］數(shù)據(jù)可知，由酵母菌研制的BOD微生物傳感器的線性響應(yīng)范圍為0～200mg/L，響應(yīng)時間為15min，穩(wěn)定地工作壽命在3個月以上;大腸桿菌BOD微生物傳感器在0～500mg/L的BOD濃度范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，工作壽命略長，在4～6個月以上，其線性相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.99以上，響應(yīng)時間縮短為12min內(nèi)。而LY－07微生物薄膜線性響應(yīng)范圍可達(dá)2～4000 mg/L，響應(yīng)時間低于為8min，使用壽命30d以上，甚至可長達(dá)12個月，是迄今文獻(xiàn)報道中使用壽命最長的BOD微生物薄膜，推測可能與微生物膜的機(jī)械強(qiáng)度和性能較高以及微生物菌種的類型有關(guān)。

2.4 儀器工作參數(shù)的校正方式

儀器工作參數(shù)采用單點(diǎn)多次校正。

2.5 儀器的準(zhǔn)確度及精密度

2.5.1 準(zhǔn)確度

根據(jù)中國環(huán)境監(jiān)測總站提供的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 準(zhǔn)確度檢驗(yàn)

2.5.2 精確度

根據(jù)中國環(huán)境監(jiān)測總站規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，采用谷氨酸和葡萄糖各150 mg溶解并定容至100 mL，其BOD值為(2000±370)mg/L，連續(xù)測定8次，結(jié)果如表2所示。

表2 精確度檢驗(yàn)

由準(zhǔn)確度及精密度可以發(fā)現(xiàn)，LY－07型BOD智能生物檢測儀測量的準(zhǔn)確度與精確度較好。

2.6 儀器的測定周期

LY－07型BOD智能生物檢測儀的測定周期較短，響應(yīng)時間最多不超過10min，一般為3～5min，洗脫時間為15min左右(并且現(xiàn)在洗脫時間也在大大縮短，5min時亦可獲得較好數(shù)據(jù)，見表3)。總之，一般均可在25min內(nèi)完成樣品的測定。

表3 洗脫時間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

由此可見，對于某些水樣，減少洗脫時間，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。

2.7 在實(shí)際工作中的應(yīng)用

工業(yè)廢水BOD測定結(jié)果的對比見表4。

表4 工業(yè)廢水BOD測定結(jié)果的對比

由表4可以看出，儀器法測定廢水中的BOD與稀釋倍數(shù)法有著較好的一致性。

為了檢驗(yàn)儀器的精密度，我們分別對第二毛紡廠和第四啤酒廠的廢水進(jìn)行了測定，結(jié)果如表5所示。

表5 儀器的精密度檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究制備的LY－07型BOD微生物膜傳感器，采用了優(yōu)良菌種及利于微生物生存和新陳代謝的固定化方法，與報道的同類研究相比較，具有使用壽命長，微生物膜機(jī)械強(qiáng)度和性能好，易于多次更換使用，測定周期短(可減少洗脫時間)，且具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度等特點(diǎn)。在環(huán)境監(jiān)測的實(shí)際應(yīng)用中，與經(jīng)典的碘量法相比較，具有較好的相關(guān)性，結(jié)果表明:LY－07型BOD微生物膜傳感器的研發(fā)及其在環(huán)境監(jiān)測中的使用是具有實(shí)際意義的，使BOD在線監(jiān)測即將廣泛應(yīng)用。