楊紫汐，龍文波，陳 明，劉 云，劉 潔，張?jiān)?，孫興旺△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院病理教研室，四川瀘州 646000)

人乳頭瘤病毒(HPV)分為低危型(LR-HPV)和高危型(HR-HPV)兩類，前者主要引起低級別上皮內(nèi)病變，后者不僅能引起高級別病變，同時(shí)有導(dǎo)致癌變的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。HR-HPV具有基因型的差異，在致癌能力和致病形式上存在許多區(qū)別[3]。研究HR-HPV基因型的分布特點(diǎn)，有助于優(yōu)化利用地區(qū)醫(yī)療資源，開發(fā)更經(jīng)濟(jì)高效的防治手段。

本研究采用2 466例女性宮頸脫落細(xì)胞DNA樣本，采用熒光定量PCR技術(shù)對13種HR-HPV基因型進(jìn)行檢測，并研究HPV的病毒載量與上皮內(nèi)病變程度的相關(guān)性，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本來源為2014-2017年在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的女性患者。從樣本庫中總計(jì)獲得2 466個(gè)患者宮頸脫落細(xì)胞的DNA樣本?；颊吣挲g16～77歲，平均(39.7±9.4)歲，均先進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)。組織病理學(xué)檢查確定有病變或可疑樣本的病變情況(合計(jì)1 469例)。本研究的體外試驗(yàn)程序通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和定量PCR檢測 脫落細(xì)胞懸液樣本試管加入1.0 mL無菌水，震蕩混勻，吸取適量液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，之后離心收集細(xì)胞和組織。DNA提取和定量PCR檢測13種HR-HPV基因型(HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59和HPV-68)按照上海之江生物科技股份有限公司的HR-HPV分型核酸測定試劑盒方法進(jìn)行。定量PCR檢測的內(nèi)參基因?yàn)槿祟惢蚪M進(jìn)化上保守的雙底物特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶a(DYRK1a)。

1.2.2 宮頸病變診斷 TCT細(xì)胞學(xué)檢查按照2001年國際病理學(xué)會(huì)修訂的TBS系統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：未見上皮內(nèi)病變或惡性細(xì)胞(NILM)，包括正常和炎癥組織；能明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞/含不能排除高級別病變(ASC-US/H)；低級別鱗狀上皮病變(LSIL)；高級別鱗狀上皮病變(HSIL)；鱗狀細(xì)胞癌(SCC)；不典型腺細(xì)胞(AGO)和宮頸腺癌(ECA)。對檢測到上皮內(nèi)病變或惡性細(xì)胞的病例進(jìn)行的病理學(xué)檢查，按照2014年WHO(第4版)標(biāo)準(zhǔn)分類：(1)炎癥和良性病變：包括宮頸炎、宮頸納氏囊腫、宮頸肥大、觸血、糜爛、尖銳濕疚、息肉等；(2)宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ：輕度CIN，相當(dāng)于LSIL；(3)CINⅡ和CINⅢ：分別為中度和重度CIN，相當(dāng)于HSIL，其中CINⅢ包含原位癌；(4)宮頸癌：浸潤性宮頸癌；(5)其他為術(shù)后復(fù)查病例等。

1.2.3 相關(guān)性分析賦值 相關(guān)性分析中定義上皮內(nèi)病變CINⅠ至CINⅢ按惡性程度分別對應(yīng)分值為1～3分，宮頸癌對應(yīng)分值為4分，正常宮頸、炎癥和良性病變及其他組對應(yīng)分值為0分。HPV病毒的DNA載量計(jì)算公式：DNA載量=2內(nèi)參CT值-HPV擴(kuò)增CT值，CT值即PCR擴(kuò)增的循環(huán)閾值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件處理統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸病變分布 細(xì)胞學(xué)檢查為LSIL的樣本97個(gè)，經(jīng)組織病理學(xué)診斷為CINⅠ的有70個(gè)(72.16%)；細(xì)胞學(xué)檢查為HSIL的樣本136個(gè)，經(jīng)組織病理學(xué)診斷為CINⅡ～Ⅲ的有112個(gè)(82.35%)；細(xì)胞學(xué)查見癌細(xì)胞的樣本37個(gè)，經(jīng)組織病理學(xué)診斷為浸潤性宮頸癌的有30個(gè)，符合率81.08%；細(xì)胞學(xué)檢查為ASC-US/H的樣本38個(gè)，經(jīng)組織病理學(xué)診斷符合良性和炎癥病變的21個(gè)(55.26%)，符合CINⅠ的有16個(gè)(42.11%)，符合CINⅡ～Ⅲ的1個(gè)(2.63%)。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)存在炎癥、良性病變和惡性病變的樣本合計(jì)1 469個(gè)，其分布為：炎癥和良性病變(1 064/1 469，72.43%)，CINⅠ(99/1 469，6.74%)，CINⅡ～Ⅲ(132/1 469，8.99%)，宮頸癌(33/1 469，2.25%)及其他(141/1 469，9.60%)，見表1。在>30～40年齡組中，CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌患者的分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.074)，但是CINⅠ和CINⅡ～Ⅲ的比例隨著年齡增長有所增加(P<0.05)。宮頸癌的病例超過80%出現(xiàn)在大于40年齡組中，且隨年齡增大比例增加，見表2。

表1 2 466例樣本的HPV感染情況

2.2 HR-HPV基因型的分布 在2 466個(gè)樣本中，總計(jì)檢測到575個(gè)(23.32%)HR-HPV感染樣本，其中468個(gè)(81.39%)為單基因型感染，90個(gè)(15.65%)為雙基因感染，14個(gè)(2.43%)為3基因型感染，還有3個(gè)(0.52%)為4基因型感染(表3)。在50歲以下的患者中，HR-HPV的感染率接近，在16～30、>30～40和>40～50組中分別為23.19%(109/470)、23.66%(176/744)和21.38%(217/1 015)。但在大于50歲患者中，HR-HPV的感染率明顯提高，在>50～60和>60組中分別達(dá)到29.63%(56/189)和35.42%(17/48)。

表2 不同年齡段患者宮頸的上皮內(nèi)病變情況[n(%)]

表3 HPV感染的基因型數(shù)目分布情況[n(%)]

HPV不同基因型中，感染頻率最高的是HPV-52，總共在154個(gè)(26.78%)HR-HPV感染樣本中檢測到，其余基因型依次為HPV-16(24.87%)、HPV-58(20.52%)、HPV-51(9.22%)、HPV-39(8.35%)、HPV-33(5.74%)、HPV-56(5.57%)、HPV-35(4.70%)、HPV-31(4.00%)、HPV-18(4.00%)、HPV-59(3.83%)、HPV-68(2.96%)和HPV-45(1.57%)。HPV-52、HPV-16和HPV-58是HPV感染的主要類型，三者在HR-HPV感染樣本中所占比例合計(jì)達(dá)72.17%。但是，盡管HPV-52總感染率最高，在CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌樣本中，HPV-16(25.00%、57.58%)和HPV-58(16.67%、12.12%)的比例卻超過HPV-52(11.36%、3.03%)。此外，HPV-33在CINⅡ～Ⅲ樣本中也有較高比例(11.36%)。除HPV-52、HPV-16和HPV-58外，HPV-51、HPV-39、HPV-33和HPV-56的在HR-HPV感染樣本中的比例均超過5.00%，合計(jì)共28.88%。各基因型在不同病癥的分布見圖1。

圖1 2 466個(gè)樣本的HPV基因型按照病癥表現(xiàn)分布

HPV基因型與年齡的相關(guān)關(guān)系相關(guān)系數(shù)P與宮頸上皮病變程度的相關(guān)關(guān)系相關(guān)系數(shù)P160.1560.0670.2030.015180.4440.0390.1970.38031-0.0540.8050.0610.782330.1060.5580.1150.523350.0600.771-0.2040.31939-0.0010.993-0.1040.48645-0.4770.232-0.1900.624510.1040.4610.0450.74752-0.2100.802-0.1900.81556-0.0060.9760.0990.60258-0.1830.0510.3090.00159-0.0470.846-0.0750.75568-0.4460.110-0.1980.498合計(jì)-0.0090.8120.209<0.01

2.3 HPV的DNA載量與上皮內(nèi)病變程度的相關(guān)性分析 HPV病毒的DNA載量與上皮內(nèi)病變程度呈正相關(guān)(P<0.01)，而與患者年齡沒有明顯相關(guān)性(P=0.812)。HPV-16和HPV-58的DNA載量與上皮內(nèi)病變程度呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，HPV-18與年齡呈正相關(guān)(P=0.039)，見表4。

3 討 論

HPV感染是宮頸癌的關(guān)鍵誘發(fā)因素。本研究分析了川南地區(qū)HR-HPV感染的分布特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)2 246例患者樣本中HR-HPV的總感染率為23.32%，接近中國地區(qū)大樣本研究結(jié)果[4]。其中宮頸癌樣本HR-HPV的檢出率為81.82%，符合其他不同地區(qū)研究報(bào)道的80%～96%的感染率[1,5]。

世界范圍內(nèi)HR-HPV基因型的分布具有地域特點(diǎn)，但在總體上以HPV-16和HPV-18感染率最高[1,5]。而本研究感染率最高的5個(gè)基因型為HPV-52、HPV-16、HPV-58、HPV-51和HPV-39，而HPV-18較低。這可能是因?yàn)镠PV-18主要出現(xiàn)在腺癌[6]，本地區(qū)的宮頸癌樣本基本都是鱗癌所致。HPV-52和HPV-58的感染率極高，在2 466個(gè)樣本中分別占第1和第3位，表明在亞洲東部這兩種基因型可能具有很強(qiáng)的導(dǎo)致上皮病變能力[7-9]。然而，在CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌樣本中，HPV-16的感染率最高遠(yuǎn)超過其他基因型，表明HPV-16是最能引起惡性上皮內(nèi)瘤變的基因類別[10]。值得注意的是，HPV-58在CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌樣本中的感染率僅次于HPV-16，提示在川南地區(qū)HPV-58可能是也是極具危害性的基因類型。

目前學(xué)界已經(jīng)知道，HPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要因素之一。HPV感染常無臨床癥狀，感染平均持續(xù)時(shí)間8～12個(gè)月，高危型的平均清除時(shí)間為8～14個(gè)月，但是HPV-16和HPV-18持續(xù)感染的時(shí)間更長[11]。2015年美國陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)和婦科腫瘤協(xié)會(huì)臨床指導(dǎo)指出：如果HPV-16和HPV-18陽性，無論TCT結(jié)果如何都建議進(jìn)行陰道鏡檢查；如果其他HR-HPV陽性，細(xì)胞學(xué)無異常，建議1年內(nèi)隨訪[12]。本研究提示HPV-58在川南地區(qū)具有極強(qiáng)的致高級別上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌能力，危害性僅次于HPV-16，高于本研究其余的HR-HPV基因型。因此，對川南地區(qū)的HPV-58陽性患者，即使其細(xì)胞學(xué)無異常，可能也有必要進(jìn)一步進(jìn)行組織學(xué)檢查或進(jìn)行更密切的臨床隨訪。

目前研究表明，HR-HPV病毒的DNA載量與宮頸病變存在明顯正相關(guān)關(guān)系，可能作為預(yù)測宮頸病變程度的生物學(xué)標(biāo)記[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)HPV病毒的DNA載量與上皮內(nèi)病變程度呈明顯正相關(guān)(P<0.01)，與該觀點(diǎn)一致。大量的病毒DNA感染導(dǎo)致機(jī)體清除機(jī)制更難發(fā)揮作用，因而長期持續(xù)感染某一亞型更容易導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生[16-18]。然而，本研究HR-HPV的13種基因型中，僅有HPV-16和HPV-58的DNA載量與上皮內(nèi)病變程度呈明顯正相關(guān)，其余基因型均無明顯相關(guān)性。提示HPV-16和HPV-58型致宮頸上皮病變可能具有不同于其余亞型的作用機(jī)制，其DNA載量有可能作為檢測的生物學(xué)標(biāo)記，但這一點(diǎn)還需更多研究加以證明。