吳 瑗，王 欣，趙漢寧

(廣東醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣東湛江 524023)

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。盡管肝癌的診斷和治療獲得了很大的提高，但預(yù)后仍欠佳，侵襲轉(zhuǎn)移是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、療效差的主要原因[1-2]。因此，探討肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制，尋找肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測標(biāo)記及干預(yù)治療靶點，顯得尤為重要。胎盤特異基因1(placenta-specific 1，Plac1)最初被認(rèn)為是胎盤特異表達(dá)的新基因，人Plac1基因定位在Xq26.3，全長92 641 bp，含3個外顯子，第3外顯子為編碼區(qū)，共編碼212個氨基酸，在正常組織中的表達(dá)主要局限于胎盤，參與調(diào)控胎盤的生物學(xué)功能[3-4]。但目前越來越多的研究表明，Plac1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。有實驗證實， Plac1在乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤組織高表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系[5-7]。也有研究者發(fā)現(xiàn)，Plac1在肝癌細(xì)胞及肝癌組織中的表達(dá)水平也上調(diào)[8]，但其在肝癌中具體的作用機制未明確。本實驗應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計構(gòu)建3條Plac1基因的小分子干擾RNA(siRNA)序列，旨在篩選出最為有效的序列，為進(jìn)一步研究Plac1在肝癌的作用機制提供可行的工具，為后續(xù)實驗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞 細(xì)胞L02、HepG2、Bel-7402、SMMC-7721及Huh7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，HLE細(xì)胞株由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部尹艷慧教授惠贈。

1.1.2 實驗試劑與引物 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Hyclone公司，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體及RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑購自美國Promega公司，定量PCR所用SYBR Green qPCR SuperMix購自美國Invitrogen公司，Plac1抗體購自美國Abcam公司，CCK-8試劑盒購自碧云天公司。由美國Sigma公司設(shè)計及合成針對Plac1的基因序列，3條Plac1-siRNA和1條陰性對照(NC-siRNA)序列見表1。

表1 Plac1-siRNA及NC-siRNA序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 L02、HepG2、Bel-7402、HLE、SMMC-7721及Huh7均采用 DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)。待HepG2細(xì)胞處于對數(shù)生長期進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d按5×104個/孔將細(xì)胞接種于24孔板中，貼壁細(xì)胞融合率達(dá)40%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取20 μmol/L siRNA 10 μL溶于500 μL opti-MEM中，混勻，靜置(A管)。將5 μL Lipofectamine 2000加入500 μL opti-MEM中，輕輕混勻，靜置不超過5 min(B管)，將A管和B管混合，混勻，靜置20 min；然后分別加入各孔中，混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，4～6 h后，吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后用定量PCR檢測siRNA的基因干擾效率。實驗分為3組：實驗組、陰性對照組、空白對照組，其中實驗組為轉(zhuǎn)染Plac1-siRNA組，陰性對照組為轉(zhuǎn)染NC-siRNA組，空白對照組為僅加入轉(zhuǎn)染混合液。

1.2.2 實時定量PCR(qPCR)檢測Plac1 mRNA的表達(dá) 按照Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，然后檢測總RNA純度和完整性，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用以下引物進(jìn)行qPCR檢測。PLAC1-F1：5′-TAA GGG CAC GCC ATC TAA GT-3′，PLAC1-R1：5′-GGA CTG TGA CAA GCT GAA CAC-3′；18srRNA-F：5′-CCT GGA TAC CGC AGC TAG GA-3′，18srRNA-R：5′-GCG GCG CAA TAC GAA TGC CCC-3′。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，讀板，40個循環(huán)，每個樣品重復(fù)3次。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測Plac1蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞后提取總蛋白并測定水平，將待測蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后煮沸10 min，定量上樣并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，于4 ℃進(jìn)行印跡電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃過夜，洗滌后加入二抗，室溫避光孵育2 h。洗滌后將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，并使反應(yīng)持續(xù)5 min。用濾紙吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒，顯影，掃描及分析。Plac1的灰度值與3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)灰度值計算相對比值。

1.2.4 細(xì)胞增殖及遷移能力的檢測 采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力，消化細(xì)胞后吹打散細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/毫升，分到96孔板，每孔100 μL，即每孔細(xì)胞為1×104個。待細(xì)胞貼壁后，再收集各個時間點的細(xì)胞(0、24、48、72 h)加入CCK-8溶液，比例為1∶10，即100 μL培養(yǎng)液加入10 μL檢測液。孵育4 h后，酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度(A450) 值，每孔復(fù)測3次，取結(jié)果的平均值。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力的檢測 采用美國BD公司Transwell小室，取對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)1×105個/毫升，用100 μL無血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的小室上室，在下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。 在37 ℃ 5% CO2孵育48 h后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌1次，顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 Plac1在多種肝癌細(xì)胞中的表達(dá) qPCR結(jié)果顯示，Plac1 mRNA在正常肝細(xì)胞L02的表達(dá)水平較低，而在HLE、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402及HepG2等肝癌細(xì)胞的表達(dá)水平均明顯高于正常肝細(xì)胞L02(P<0.05)，見圖1；Western blot結(jié)果顯示，Plac1蛋白在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。在上述5種肝癌細(xì)胞中，HepG2細(xì)胞的Plac1 mRNA及蛋白表達(dá)水平最高，故選取HepG2細(xì)胞作為目的細(xì)胞進(jìn)行siRNA干擾沉默Plac1基因，開展后續(xù)的實驗。

A：Plac1 mRNA在肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞的表達(dá)；B：Plac1蛋白在肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞的表達(dá)；1：HLE；2：SMMC-7721；3：Bel-7402；4：L02；5：Huh7；6：HepG2；*：P<0.05，與L02比較

圖1 Plac1在肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞的表達(dá)

2.2 篩選沉默Plac1基因的siRNA 為了有效沉默Plac1基因，針對Plac1基因序列設(shè)計了3條siRNA，應(yīng)用qPCR篩選最佳序列，結(jié)果顯示：3條siRNA序列轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，Plac1-siRNA1、Plac1-siRNA2及Plac1-siRNA3組的Plac1 mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，與NC-siRNA組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而空白對照組與NC-siRNA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。3條序列中以Plac1-siRNA1的抑制作用最強，其抑制率達(dá)到96%，故選取siRNA-1用于后續(xù)實驗。

*：P<0.05，與NC-siRNA組比較

圖2 Plac1 mRNA在肝癌細(xì)胞HepG2的表達(dá)

2.3 siRNA-1抑制肝癌細(xì)胞Plac1蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，Plac1在HepG2細(xì)胞的空白對照組與NC-siRNA組的表達(dá)較高，而在Plac1-siRNA1組的表達(dá)明顯下調(diào)(圖3A)。對Western blot蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描后分析，結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞Plac1-siRNA1組的Plac1/GAPDH比值明顯低于NC-siRNA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其比值下調(diào)95%；NC-siRNA組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3B。此結(jié)果與q-PCR的結(jié)果相吻合，進(jìn)一步驗證了siRNA1確實可有效沉默Plac1基因。

A：Western blot檢測Plac1在HepG2細(xì)胞的表達(dá)；B：HepG2細(xì)胞Plac1蛋白的相對表達(dá)水平；1：空白對照組；2：NC-siRNA組；3：Plac1-siRNA1組;*：P<0.05，與NC-siRNA組比較

圖3 Plac1蛋白在HepG2細(xì)胞的表達(dá)

2.4 siRNA1沉默Plac1后對肝癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響 Plac1-siRNA1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，CCK-8法檢測其對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示培養(yǎng)24、48及72 h后，Plac1-siRNA1組的細(xì)胞增殖活性均下調(diào)，與NC-siRNA組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而空白對照組與NC-siRNA組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其中以轉(zhuǎn)染72 h的抑制效果最為顯著，見圖4A。Transwell實驗結(jié)果顯示，與空白對照組及NC-siRNA組比較，siRNA1沉默Plac1后可以明顯抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力(圖4B)。

A：細(xì)胞增殖；B：細(xì)胞遷移(×200);*:P<0.05,與NC-siRNA組比較

圖4 Plac1影響肝癌細(xì)胞增殖及遷移能力

3 討 論

隨著深入的研究，Plac1在腫瘤的作用被不斷證實，研究顯示其屬于癌-睪丸(cancer-testis，CT)抗原，在多種腫瘤細(xì)胞株(如宮頸癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、絨毛膜癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等)呈高水平表達(dá)[9]，并且在肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌及前列腺癌等多種腫瘤組織的表達(dá)水平也高于正常組織[5-8，10]。有研究顯示，Plac1的表達(dá)水平與胃癌及胰腺癌的生存期呈負(fù)相關(guān)[7，10]，與前列腺癌Gleason評分呈正相關(guān)[6]，Plac1可能成為判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物之一。另有不少的研究表明，Plac1具有免疫原性，可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，從而起到抗腫瘤的作用，因此可作為腫瘤免疫治療的靶點[7-8，11]。本研究結(jié)果顯示，5種肝癌細(xì)胞HepG2、Bel-7402、HLE、SMMC-7721及Huh7的Plac1表達(dá)水平均明顯高于正常肝細(xì)胞，預(yù)示Plac1的異常表達(dá)可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體作用機制仍未明確。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是目前較為有效的基因表達(dá)沉默技術(shù)，已經(jīng)成為研究基因功能和疾病基因治療的重要工具，其利用siRNA對同源序列mRNA進(jìn)行識別并降解，從而導(dǎo)致特定基因減效表達(dá)或不表達(dá)[12]。為研究Plac1在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究針對Plac1基因設(shè)計3條siRNA序列，成功篩選了有效沉默Plac1的siRNA1序列，從而為進(jìn)一步探討Plac1在調(diào)控腫瘤形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的作用提供了研究工具。有文獻(xiàn)報道沉默Plac1基因后，乳腺癌細(xì)胞的增殖降低，細(xì)胞生長停滯在G1/S期，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Plac1基因沉默所致的細(xì)胞周期失調(diào)與周期蛋白D1(Cyclin D1)及磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路有關(guān)，而且沉默Plac1基因可顯著降低乳腺癌細(xì)胞的趨化遷移和侵襲能力[5]。為探究沉默Plac1能否影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，本研究初步的體外細(xì)胞生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)，siRNA1沉默Plac1后，肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力及遷移能力均顯著低于空白對照組。由此可見，Plac1很有可能通過調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其具體機制有待進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，本研究針對Plac1基因序列，篩選出具有特異性沉默Plac1表達(dá)的干擾序列，并且此序列有效抑制了Plac1的功能，為進(jìn)一步研究Plac1基因功能及細(xì)胞生物學(xué)行為奠定了基礎(chǔ)。