吳杏兒，孫世珺，鄭 磊

(1.廣東省中山市人民醫(yī)院分子診斷中心 528403；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510515)

胰島β細(xì)胞受損是2型糖尿病(T2DM)的特征之一[1]。血循環(huán)中游離脂肪酸(FFAs)升高可引起胰島β細(xì)胞數(shù)量明顯減少[2]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FAs對(duì)嚙齒類動(dòng)物及人的胰島β細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡及抑制增殖的效應(yīng)[2-3]。迄今已有大量研究闡釋FFAs如何誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，如FFAs激活神經(jīng)酰胺通路、引起線粒體膜損傷等機(jī)制已被證實(shí)與β細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密[3-4]。然而，F(xiàn)FAs抑制胰島β細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明確。進(jìn)一步研究FFAs抑制胰島β細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，有助于了解脂毒性參與糖尿病發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，以及為可能的藥物開(kāi)發(fā)甚至治療策略改進(jìn)提供依據(jù)。Wnt信號(hào)通路是一類參與調(diào)節(jié)器官發(fā)育、細(xì)胞有絲分裂等過(guò)程的重要信號(hào)通路，其不同層面的信號(hào)分子在胰腺組織中均有不同程度的表達(dá)[5]。目前鼠及人類Wnt配體家族成員已知的有19個(gè)，不同的Wnt蛋白亞型可起不同的生物學(xué)效應(yīng)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a亞型在β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞及小鼠胰島中基礎(chǔ)表達(dá)豐度高，可通過(guò)激活鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)通路下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達(dá)；此外，首次報(bào)道了Wnt5a是抑制β細(xì)胞增殖的重要調(diào)控基因[6]。有研究表明，Wnt5a與脂代謝紊亂密切相關(guān)[7]。然而Wnt5a是否參與介導(dǎo)脂毒性抑制β細(xì)胞增殖尚未明確。本實(shí)驗(yàn)利用飽和脂肪酸棕櫚酸(PA)刺激大鼠胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞，觀察其對(duì)Wnt5a基因表達(dá)的調(diào)控作用，探討PA抑制胰島β細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，為進(jìn)一步理解脂毒性損傷β細(xì)胞及治療糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大鼠胰島β細(xì)胞瘤INS-1細(xì)胞[美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)細(xì)胞庫(kù)]。小牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；PA、牛血清蛋白(BSA)、2-巰基乙醇、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)；小干擾RNA(siRNA，廣州吉捷生物科技有限公司)；EdU試劑盒(銳博生物技術(shù)公司)；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、PCR引物(美國(guó)Invitrogen公司)；兔抗鼠Wnt5a抗體、兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，14C10)抗體(美國(guó)Cell Signal Technology公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG(弗德生物技術(shù)有限公司)；Eastep通用型總RNA提取試劑盒、GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、GoTaq?qPCR Master Mix(美國(guó)Promaga公司)。熒光定量PCR儀7500(美國(guó)ABI公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 大鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞INS-1培養(yǎng)在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱，每100毫升細(xì)胞培養(yǎng)液含有10%小牛血清、1%青/鏈霉素雙抗、2-巰基乙醇0.35 μL、碳酸氫鈉0.2 g、10 μmol/L HEPES 0.1 mL。以含0.25%胰酶消化細(xì)胞傳代，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞分組：(1)EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組(BSA組)，200 μmol/L PA刺激24、48 h組，500 μmol/L PA刺激24、48 h組，1 000 μmol/L PA刺激24、48 h組；(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為：溶劑對(duì)照組，200 μmol/L PA刺激1、6、12、24 h組，以及200、500、1 000 μmol/L PA刺激6 h組；(3)Western blot實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為：溶劑對(duì)照組，200 μmol/L PA刺激1、3、6、12、24、36 h組，以及200、500、1 000 μmol/L PA刺激6 h組；(4)siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為：轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA組(NC組)、轉(zhuǎn)染siRNA-Wnt5a-1組、轉(zhuǎn)染siRNA-Wnt5a-2組、轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA+500 μmol/L PA組、轉(zhuǎn)染siRNA-Wnt5a-1+500 μmol/L PA組、轉(zhuǎn)染siRNA-Wnt5a-2+500 μmol/L PA組(轉(zhuǎn)染培養(yǎng)36 h后予 PA繼續(xù)共培養(yǎng)24 h)。

1.2.2 EdU標(biāo)記染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 細(xì)胞染色：細(xì)胞以4×104個(gè)/孔密度種植至鋪有蓋玻片的24孔板，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)染或共培養(yǎng)，離觀察終點(diǎn)2 h前往培養(yǎng)基中加入EdU溶液(終濃度為50 μmol/L)，按試劑盒說(shuō)明固定細(xì)胞、染色及鋪片。細(xì)胞增殖率計(jì)數(shù)：使用倒置熒光顯微鏡，觀察Appolo567染色使用550 nm激發(fā)光，觀察Hoechst3342染色使用350 nm激發(fā)光，放大倍數(shù)為400倍。每復(fù)孔等分4象限，每個(gè)象限隨機(jī)拍攝3張不同視野照片均計(jì)數(shù)，分別計(jì)算細(xì)胞核(Hoechst)及增殖細(xì)胞(Appolo)染色細(xì)胞數(shù)，Appolo/Hoechst比值為細(xì)胞增殖率，每復(fù)孔Hoechst染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)大于1 000個(gè)。同組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取增殖率平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.3 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染siRNA 按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明，分別將含有1 μg無(wú)意義siRNA，Wnt5a-siRNA-1(5′-CAA GGA AUU CGU GGA CGC ACG AGA AdT d-3′，5′-UUC UCG UGC GUC CAC GAA UUC CUU GdT d-3′)及Wnt5a-siRNA-2(5′-GCA UCC UCA UGA ACU UGC ACA ACA AdT d-3′，5′-UUG UUG UGC AAG UUC AUG AGG AUG CdT d-3′)稀釋液加入含無(wú)血清培養(yǎng)基的EP管中混勻，緩慢加至含1 μL LipofectamineTM2000的50 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻后室溫靜置20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。使用轉(zhuǎn)染復(fù)合物培養(yǎng)細(xì)胞6～8 h后吸出轉(zhuǎn)染復(fù)合物，換含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，總培養(yǎng)時(shí)間為36 h。到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)收集細(xì)胞用于Western blot檢測(cè)或EdU標(biāo)記染色進(jìn)行細(xì)胞增殖率計(jì)數(shù)。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)Wnt5a表達(dá)水平 RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA：按試劑盒說(shuō)明柱提法冰面操作提對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞總RNA，行反轉(zhuǎn)錄。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：25 ℃退火5 min，延伸1 h，70 ℃滅活15 min。cDNA樣本-20 ℃保存?zhèn)溆谩T-PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體系為20 μL，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物樣品5 μL，無(wú)酶核酸水4 μL，正、反向引物各0.8 μL，Master Mix 2×10 μL。CXR100×0.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s后60 ℃ 1 min(40個(gè)循環(huán))。mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-△△Ct方法計(jì)算，內(nèi)標(biāo)基因?yàn)棣?actin。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞Wnt5a的表達(dá) 按分組處理細(xì)胞，提取蛋白后用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，4% BSA封閉2 h，PBS洗膜3次后加一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜3次加二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后于暗室中加入發(fā)光劑，顯影后定影。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件灰度掃描圖像檢測(cè)Wnt5a蛋白表達(dá)差異。

2 結(jié) 果

2.1 PA對(duì)INS-1細(xì)胞增殖的影響 EdU標(biāo)記法檢測(cè)不同濃度PA處理INS-1細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞增殖率的變化，結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，PA各濃度處理組或同一濃度不同時(shí)間組的細(xì)胞增殖率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， PA抑制INS-1細(xì)胞增殖具有濃度及時(shí)間依賴性，見(jiàn)圖1。

A：EdU標(biāo)記細(xì)胞增增率分析圖；B：不同濃度PA處理細(xì)胞24 h后EdU標(biāo)記染色圖(×400)；*：P<0.05，與溶劑對(duì)照組(0 h)比較

圖1 PA對(duì)INS-1細(xì)胞增殖的影響

A：200 μmol/L PA處理細(xì)胞不同時(shí)間后Wnt5a mRNA表達(dá)水平；B：不同濃度PA處理細(xì)胞6 h后Wnt5a mRNA表達(dá)水平；*：P<0.05，與溶劑對(duì)照組比較

圖2 PA對(duì)INS-1細(xì)胞Wnt5a mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.2 PA對(duì)INS-1細(xì)胞Wnt5a mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 qRT-PCR檢測(cè)200 μmol/L PA處理細(xì)胞后Wnt5a mRNA隨時(shí)間表達(dá)變化，結(jié)果顯示，自6 h起細(xì)胞Wnt5a mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。使用不同濃度PA刺激細(xì)胞6 h，結(jié)果顯示，細(xì)胞Wnt5a mRNA表達(dá)水平隨 PA濃度升高逐漸增加(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。

2.3 PA對(duì)INS-1細(xì)胞Wnt5a蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot檢測(cè)200 μmol/L PA處理細(xì)胞后Wnt5a蛋白隨時(shí)間表達(dá)變化，結(jié)果顯示，自6 h起細(xì)胞Wnt5a的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。使用不同濃度PA刺激細(xì)胞6 h，結(jié)果顯示，細(xì)胞Wnt5a的蛋白表達(dá)水平隨PA濃度升高逐漸增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。

2.4 沉默Wnt5a表達(dá)對(duì)PA抑制INS-1細(xì)胞增殖的影響 使用兩組不同的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染沉默Wnt5a，轉(zhuǎn)染36 h后Western blot驗(yàn)證siRNA序列的有效性，見(jiàn)圖4。使用siRNA-Wnt5a轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后予500 μmol/L PA繼續(xù)刺激細(xì)胞24 h，EdU標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA情況下，PA降低細(xì)胞增殖率；沉默Wnt5a后PA抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

A：200 μmol/L PA處理細(xì)胞不同時(shí)間后Wnt5a的蛋白表達(dá)水平；B：不同濃度PA處理細(xì)胞6 h后Wnt5a的蛋白表達(dá)水平；*：P<0.05，與溶劑對(duì)照組比較

圖3 PA對(duì)INS-1細(xì)胞Wnt5a蛋白表達(dá)的影響

A：Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA或siRNA-Wnt5a各組中Wnt5a蛋白表達(dá)；B:轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA或siRNA-Wnt5a各組中Wnt5a蛋白表達(dá)分析圖；*：P<0.05，與轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA(NC組)比較

圖4轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA或siRNA-Wnt5a各組中Wnt5a蛋白表達(dá)

A：轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞EdU標(biāo)記染色圖(×400)；B：轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞增殖率分析圖；*：P<0.05，與NC+PA組比較

圖5 EdU標(biāo)記轉(zhuǎn)染siRNA-Wnt5a對(duì)PA抑制INS-1細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

脂毒性與β細(xì)胞數(shù)量減少密切相關(guān)，F(xiàn)FAs對(duì)β細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡及抑制增殖的效應(yīng)，大量研究已經(jīng)對(duì)FFAs如何誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡進(jìn)行了詳盡的機(jī)制闡釋：如在多種不同來(lái)源的胰島β細(xì)胞中神經(jīng)酰胺通路已被證實(shí)與β細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密[3]，F(xiàn)FAs介導(dǎo)線粒體膜損傷導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子(如細(xì)胞色素C)釋放，可誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡[4]。然而，F(xiàn)FAs抑制胰島β細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不清楚。在T2DM疾病發(fā)展過(guò)程中，脂、糖代謝紊亂常相伴出現(xiàn)，F(xiàn)FAs可明顯抑制葡萄糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞增殖，具有分泌功能的β細(xì)胞數(shù)量減少，機(jī)體最終失代償發(fā)展成為T2DM[8]。因此，探索FFAs抑制β細(xì)胞增殖的機(jī)制對(duì)理解T2DM發(fā)病機(jī)制及研究治療策略十分重要。

大量報(bào)道顯示，Wnt5a與脂代謝紊亂關(guān)系密切：T2DM大鼠肝臟Wnt5a表達(dá)水平明顯升高[7]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中Wnt5a基因敲除可減輕脂肪組織的炎性反應(yīng)，并同時(shí)改善胰島素抵抗[9]。Wnt5a及其受體廣泛表達(dá)于多種組織，HELLER等[10]通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在人胰島中Wnt5a是Wnt配體家族中表達(dá)豐度最高的亞型之一。過(guò)去發(fā)現(xiàn)Wnt5a在調(diào)控β細(xì)胞遷移及胰島發(fā)育的過(guò)程中起重要作用，但鮮有研究探索Wnt5a在調(diào)控β細(xì)胞增殖中的作用。筆者前期研究證明，Wnt5a是抑制β細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子[6]。因此，本研究著重于探索Wnt5a是否參與介導(dǎo)FFAs抑制β細(xì)胞增殖。本研究使用了飽和脂肪酸PA刺激大鼠胰島β細(xì)胞INS-1，通過(guò)EdU標(biāo)記染色觀察到細(xì)胞增殖明顯被抑制。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)PA促進(jìn)Wnt5a mRNA及蛋白的表達(dá)呈濃度及時(shí)間依賴性。為了進(jìn)一步闡明Wnt5a在PA抑制INS-1細(xì)胞增殖中的作用，本研究使用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有效的siRNA序列沉默Wnt5a基因表達(dá)，再給予PA刺激細(xì)胞。通過(guò)EdU標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染無(wú)意義siRNA+PA組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-Wnt5a+PA組細(xì)胞增殖率明顯回升，表明Wnt5a參與介導(dǎo)PA抑制INS-1細(xì)胞增殖過(guò)程，PA通過(guò)上調(diào)Wnt5a基因表達(dá)抑制INS-1細(xì)胞增殖。

本研究觀察到PA可調(diào)控INS-1細(xì)胞Wnt5a基因表達(dá)，但相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚未闡明。有報(bào)道指出，在人類Wnt5a基因序列啟動(dòng)子區(qū)域存在核因子-κB(NF-κB)(-111/-101)、Forkhead-box(FOX，-780/-770)、Smad(-1965/-1953)等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)[11]。而在脂肪細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中PA可激活NF-κB轉(zhuǎn)錄活性[12-13]；游離脂肪酸被證實(shí)可經(jīng)FOXO1介導(dǎo)胰島素-IGF-1信號(hào)通路促進(jìn)β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞凋亡[14]。至于轉(zhuǎn)錄因子Smad2和Smad3，則有報(bào)道指出它們與部分胰腺切除術(shù)后胰島細(xì)胞增殖抑制密切相關(guān)[15]。雖無(wú)胰島β細(xì)胞或細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)提供直接證據(jù)揭示PA對(duì)Wnt5a基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，但本課題組已正在進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)驗(yàn)探索其具體機(jī)制。至于PA通過(guò)Wnt5a抑制β細(xì)胞增殖的下游通路機(jī)制，也有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。本課題組在前期已通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，基礎(chǔ)狀態(tài)下Wnt5a通過(guò)磷酸化CaMKⅡ，下調(diào)全細(xì)胞β-catenin水平，抑制β-catenin與核內(nèi)TCF/LEF形成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，最終下調(diào)細(xì)胞周期因子CycinD 1的表達(dá)，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用[6]。但PA是否也通過(guò)Wnt5a/CaMKⅡ信號(hào)通路抑制INS-1細(xì)胞增殖尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PA抑制胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞增殖，其主要機(jī)制與調(diào)控Wnt5a基因表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中PA上調(diào)Wnt5a基因表達(dá)抑制INS-1細(xì)胞增殖的具體機(jī)制并未闡明，有待進(jìn)一步研究探索。