張 展，劉 昕，高峻峻，王 萍，朱琳琳，史許鋒，常愛(ài)民

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南鄭州 450052；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000;3.河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南鄭州 450052)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)是新生兒最常見(jiàn)的氨基酸代謝障礙性疾病，是因苯丙氨酸羥化酶基因(phenylalanine hydroxylase gene,pah,612349)突變導(dǎo)致苯丙氨酸羥化酶(pah)活性下降或缺乏，導(dǎo)致血中苯丙氨酸(Phe)濃度增高并在神經(jīng)系統(tǒng)和血中蓄積[1]，造成嚴(yán)重的神經(jīng)損害，影響患兒發(fā)育，甚至危及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)苯丙酮尿癥發(fā)病率約為1∶12 189[2]，而1985-2000年中國(guó)主要城市新生兒篩查的PKU發(fā)病率為1∶11 307[3]，而近3年河南省PKU的發(fā)病率為1∶6 356，高于全國(guó)平均水平[4]。本課題組使用MLPA技術(shù)聯(lián)合Sanger測(cè)序,對(duì)河南省人群中PKU患者進(jìn)行pah基因研究，可為PKU患者的診斷以及家系的深入研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年1月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院科研中心進(jìn)行基因診斷的高苯丙氨酸血癥的患兒，通過(guò)Phe負(fù)荷試驗(yàn)、BH4負(fù)荷試驗(yàn)、尿液蝶呤譜分析確診分型并排除其他代謝性疾病的83例PKU患兒及其父母為研究對(duì)象。83例患兒的男女性別比例為41∶42，年齡30 d至10歲。所有受試者檢測(cè)均獲得患兒監(jiān)護(hù)人的知情同意，并且符合醫(yī)院人體試驗(yàn)倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1外周血DNA提取 EDTA抗凝全血采用QIAamp?DNA Blood Mini Kit (批號(hào)：51106，德國(guó)Qiagen公司)按照該試劑盒的DNA提取操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行外周血樣本的基因組DNA提取，所得樣本基因組DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后保存于-80 ℃超低溫冷藏箱中備用。

1.2.2PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序和序列分析比對(duì) 在ABI 9700 PCR(美國(guó)Applied Biosystems公司)儀上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，采用20 μL的PCR總反應(yīng)體系，其中2*Master Mix(TIANGEN)10 μL，上下游引物(表1)各0.4 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s(30次循環(huán))，72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物片段的大小，確定有目的片段并且同引物設(shè)計(jì)的目的片段大小一致后在ABI 3730測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果的峰圖以及序列比對(duì)分別采用Chromas Pro 2.1.3和Vector NTI Explorer進(jìn)行。

1.2.3多重連接探針擴(kuò)增(MLPA)法檢測(cè)pah基因大片段缺失 使用SALSA MLPA probemix P055-D1 pah kit(MRC-Holland公司，荷蘭)對(duì)測(cè)序無(wú)法進(jìn)行基因分型的PKU患者外周血基因組DNA標(biāo)本進(jìn)行pah基因大片段缺失檢測(cè)，該試劑盒含有38個(gè)探針，其中pah基因所在區(qū)域(chromosome 12q23.2)探針22個(gè)，上下游探針各1個(gè)，參考序列探針14個(gè)。MLPA反應(yīng)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物在ABI3500基因測(cè)序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳結(jié)果采用MLPA專用數(shù)據(jù)軟件Coffalyser進(jìn)行分析，拷貝數(shù)的判定根據(jù)同內(nèi)參照序列電泳峰面積的比值確定：正常2拷貝比值范圍為0.7～1.3；3拷貝(雜合重復(fù)突變)比值范圍為1.4～1.7；單拷貝(雜合缺失突變)比值范圍為0.3～0.6；純合缺失突變的比值范圍為0～0.2。

表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物

續(xù)表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物

2 結(jié) 果

2.1 河南省PKU患兒pah基因點(diǎn)突變檢測(cè)結(jié)果

在對(duì)確診的83例PKU患兒中，對(duì)其pah基因13個(gè)外顯子及其雙側(cè)剪接區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析：在166條染色體中共檢測(cè)到62種，162個(gè)基因突變，突變檢出率為97.61%。83例患兒中有4例只檢測(cè)出1條染色體上等位基因的突變，6例患兒檢測(cè)到6個(gè)大片段缺失型雜合突變，3例患兒為純合型突變，其余70例患兒均為雜合型突變。

163個(gè)突變位點(diǎn)分布于pah基因第2至第12外顯子及第2、3、4、12內(nèi)含子區(qū)域(表2)，發(fā)生突變頻率最高的區(qū)域是第6、7、11外顯子區(qū)域，占總體突變的64.1%；在所有點(diǎn)突變中，發(fā)生頻率最高突變類型的為替換突變，其突變頻率為74.4%，其余突變類型依次為剪接區(qū)突變、沉默突變、缺失突變和無(wú)義突變，突變頻率分別為13.5%、5.8%、3.8%和2.6%；突變頻率最高的位點(diǎn)為c.728G>A(p.R243Q)，突變頻率為15.38%、其次為c.611A>G(p.Y204C)、c.721C>T(p.R241C)、c.1197A>T(p.V399V) 和c.158 G>A(p.R53H)，其突變頻率依次為9.62%、7.05%、7.05%和5.13%，其余位點(diǎn)的突變頻率均在0.64%～4.49%。

表2 河南省83例PKU患兒pah基因突變情況

續(xù)表2 河南省83例PKU患兒pah基因突變情況

2.2 河南省PKU患兒pah基因大片段缺失檢測(cè)結(jié)果

在本研究中，通過(guò)MLPA技術(shù)共發(fā)現(xiàn)6例患者的pah基因出現(xiàn)大片段缺失型突變，缺失突變發(fā)生在其pah基因第1、4、5、6、7外顯子及其基因上游的調(diào)控區(qū)域，其中3例患者(PKU033、PKU039、PKU055)檢測(cè)到了發(fā)生在pah第4、5外顯子上的大片段缺失(圖1A、B、F)，其血漿Phe濃度分別為0.181、0.196 g/L和0.202 g/L(表3)；2例患者(PKU015、PKU027)檢測(cè)到了發(fā)生在pah基因第1外顯子的大片段缺失(圖1D、E)，其血漿苯丙氨酸濃度分別為0.072、0.123 g/L(表3)；1例患者(PKU012)檢測(cè)到了發(fā)生在pah基因第5、6、7外顯子的大片段缺失(圖1C)，其血漿Phe濃度分別為0.329 g/L(表3)。

A：PKU033患者在pah基因第4、5外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)大片段缺失；B：PKU039患者在pah基因第4、5外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)大片段缺失；C：PKU012患者在pah基因第5、6、7外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)大片段缺失；D：PKU015患者在pah基因第1外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)大片段缺失；E：PKU027患者在pah基因第1外顯子區(qū)域；F：PKU055患者在pah基因第4、5外顯子發(fā)現(xiàn)大片段缺失

表3 pah基因大片段缺失型PKU患者一般臨床資料

3 討 論

PKU是常見(jiàn)的遺傳代謝性疾病，其主要機(jī)制是人體內(nèi)pah 基因發(fā)生突變，導(dǎo)致pah 結(jié)構(gòu)及活性改變[5]。pah基因突變位點(diǎn)多處于外顯子或者外顯子與內(nèi)含子的交接區(qū)[6]，影響一個(gè)或多個(gè)氨基酸。根據(jù)對(duì)pah酶活性有無(wú)影響，分為沉默突變和致病突變。沉默突變對(duì)pah酶活性無(wú)影響。致病突變大部分發(fā)生在外顯子或外顯子和內(nèi)含子的交接區(qū)域，嚴(yán)重影響 pah基因轉(zhuǎn)錄和翻譯以及蛋白質(zhì)異常折疊、聚合，使其加速降解，從而影響 pah 酶的催化活性。pah基因的突變具有位置多變、類型多樣及異質(zhì)性等特點(diǎn)[7]，而且不同民族和地區(qū)之間基因突變的頻率和突變類型存在較大差異[8]。

pah突變的標(biāo)準(zhǔn)分子分析包括對(duì)所有的外顯子和外顯子邊緣的Sanger測(cè)序，同時(shí)可使用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA技術(shù))進(jìn)行補(bǔ)充[9]。pah基因的基因組DNA分析也可以被擴(kuò)展到EBV -永生化的淋巴細(xì)胞提取的cDNA分析，以確定或確認(rèn)轉(zhuǎn)錄異常[10]。Sanger測(cè)序主要用于檢測(cè)錯(cuò)義突變、剪切位點(diǎn)突變以及小片段的插入和缺失，MLPA技術(shù)則可檢測(cè)大片段的缺失、復(fù)雜的重排及拷貝數(shù)變異，二者聯(lián)合使用可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高診斷準(zhǔn)確率[11]。MLPA是基于分子診斷的敏感有效的技術(shù)，包括缺失和大型基因組區(qū)域的復(fù)制[12]。在PKU患者中，大部分等位基因突變伴隨著錯(cuò)義突變和大片段缺失。有研究采用MLPA技術(shù)，對(duì)59例未知突變等位基因的捷克PKU患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)31例患者攜帶大片段缺失突變[13]。有學(xué)者在研究羅馬尼亞人的PKU基因型頻譜時(shí)，采用Sanger測(cè)序和MLPA、 cDNA分析的結(jié)合，達(dá)到了對(duì)PKU 99%的診斷效率[14]。

本研究中pah基因的突變位點(diǎn)集中在6、7、11、12這4個(gè)外顯子及其兩端的內(nèi)含子剪接區(qū)中，同數(shù)據(jù)庫(kù)中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果和以往中國(guó)人群中pah基因突變的調(diào)查結(jié)果基本一致。本研究PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測(cè)序結(jié)果突變頻率在5%以上的熱點(diǎn)突變中c.728G>A、c.611A>G、c.1197A>T的突變頻率與以往文獻(xiàn)資料相一致[15]，而c.721C>T和c.158G>A的突變發(fā)生率較高,其頻率分別為7.05%和5.13%，同其他省份人群的PKU突變熱點(diǎn)不同[1,7,16]，提示其可能是河南人群中pah基因的特有突變。

測(cè)序后使用MLPA共檢測(cè)到6例PKU患者其pah基因發(fā)生大片段缺失突變，6例患者血漿中Phe的濃度相差較大，其中血漿中濃度最低的患者其大片段缺失發(fā)生在pah基因的第1外顯子，而發(fā)生在第5、6、7外顯子的大片段缺失突變的患者血漿中Phe的濃度最高達(dá)0.329 g/L。這種差異存在可能與大片段缺失發(fā)生的位置有關(guān)，由于pah基因第1外顯子所編碼的氨基酸位于酶蛋白的調(diào)控域，而5、6、7外顯子所編碼的氨基酸位于蛋白的活性中心域，因此當(dāng)區(qū)域發(fā)生大片段缺失突變時(shí)，酶的活性下降程度相對(duì)較大。此外，由于大片段缺失突變發(fā)生頻率相對(duì)較低，對(duì)于這種突變的基因型表型的關(guān)系研究還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入的探討。

綜上所述，使用MLPA進(jìn)行pah基因大片段缺失的檢測(cè)，是對(duì)PKU患者常規(guī)突變篩查的補(bǔ)充，為PKU患者的診斷治療以及PKU患者家系的研究提供理論依據(jù)，值得進(jìn)一步推廣和應(yīng)用于臨床診斷。