馮 龍，馬 燕，葉子瑜，顏慧敏，林碧華，林東子,，袁耀欽，李玉美，黃明元，周克元，曾今誠△

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué)東莞市醫(yī)學(xué)活性分子開發(fā)與轉(zhuǎn)化重點實驗室，廣東東莞 523808；3.廣東省東莞市第六人民醫(yī)院檢驗科 523008)

肺結(jié)核(TB)是由結(jié)核菌感染引發(fā)的肺部傳染性疾病，嚴重威脅人類健康。TB在我國發(fā)病率較高，據(jù)統(tǒng)計2013年我國新發(fā)感染TB患者900萬，其中死亡約150萬[1]。因此，我國是世界上結(jié)核疫情最嚴重的國家之一，控制TB發(fā)展和傳播是疾病防控的一大挑戰(zhàn)[2]。流行病學(xué)研究顯示，5%～10%結(jié)核菌感染者最終發(fā)展成TB，在這個過程中，宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫在控制結(jié)核菌活動過程中起重要作用[3]。

MAIT細胞是一類新的天然免疫T細胞。人MAIT細胞的T細胞受體由恒定的Vα7.2-Jα33鏈及有限的β鏈組成。絕大部分MAIT均表達CD8和CD161抗原，本文亦將CD8+CD161+T細胞視為MAIT細胞[4]。此類細胞因其嗜組織性，傾向于分布在腸道黏膜固有層而得名[4]，目前發(fā)現(xiàn)約20%肝臟T細胞，5%左右外周血T細胞均為MAIT細胞，而在肺部其含量也有較豐富[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)MAIT細胞在啟動自身免疫活化、分泌炎性反應(yīng)細胞因子、殺傷病原微生物中起著重要作用[6]。亦有研究報道小鼠MAIT細胞可以抵抗膿腫分枝桿菌的感染，缺乏這些細胞的小鼠更容易受到細菌和膿腫分支桿菌的感染[7]。盡管越來越多的證據(jù)表明T細胞在肺部免疫反應(yīng)中的重要性，但對結(jié)核菌感染過程中MAIT細胞的調(diào)節(jié)機制知之甚少，尤其是MAIT細胞功能與多種細胞因子異常表達密切相關(guān)。IL-22在屏障組織(包括腸道、皮膚和肺)防御微生物感染過程中起關(guān)鍵作用[8]。最近亦有研究發(fā)現(xiàn)MAIT細胞存在于女性生殖器黏膜中，并且在細菌感染后，產(chǎn)生IL-17和IL-22[9]。然而，IL-22產(chǎn)生的MAIT細胞在結(jié)核菌感染過程中的作用國內(nèi)外均未見明確報道。本研究通過檢測肺結(jié)核患者外周血MAIT細胞功能及血清IL-22水平，探討MAIT細胞及IL-22在抗結(jié)核免疫過程中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年1月至2017年5月在東莞市第六人民醫(yī)院(東莞市結(jié)核病定點治療醫(yī)院，原東莞市慢性病防治醫(yī)院)就診且參照《WS 288-2008肺結(jié)核診斷標準》確診的初治TB患者50例，男30例，女20例，年齡20～65歲，平均(38.2±1.8)歲。所有TB患者均行常規(guī)抗結(jié)核治療，其中常規(guī)抗結(jié)核治療前(治療3 d以內(nèi))27例，常規(guī)抗結(jié)核治療后(治療28～35 d)23例；痰涂片檢查結(jié)核菌陽性患者20例，陰性患者30例。選取與TB患者同期的健康志愿者30例為對照組，排除心、肝、腎等疾病，男20例，女10例，年齡23～58歲，平均(38.9±1.7)歲。TB患者排除標準：(1)患有嚴重肝腎疾病、心臟病和其他病情嚴重的疾??；(2)妊娠期和哺乳期婦女；(3)酗酒和吸煙嚴重；(4)有使用鎮(zhèn)靜類或其他精神類藥物；(5)合并感染艾滋病或者其他傳染病和其他(如糖尿病、腫瘤等)慢性疾??；(6)近期服用免疫調(diào)節(jié)劑或者激素治療；(7)不簽署知情同意書的患者。收集標本前均取得標本提供者知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)東莞市第六人民醫(yī)院和廣東醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1流式細胞術(shù)檢測MAIT細胞水平 所有對象均用肝素鈉管空腹采血5 mL，D-Hanks液稀釋后置于淋巴細胞分離液上。1 500 r/min離心20 min后將單個核細胞吸出、洗滌，加入CD3抗體、CD8抗體和CD161抗體室溫避光染色30 min，PBS洗滌2次，BD-FACS Calibur流式細胞分析儀檢測CD8+CD161+T細胞亞群水平。采用Flow Jo 7.6.1軟件對流式細胞儀檢測結(jié)果進行分析。

1.2.2ELISA檢測血清IL-22水平 采用ELISA法檢測血清IL-22水平，Human IL-22 ELISA檢測試劑盒為美國BioLegend公司產(chǎn)品，操作步驟嚴格按照說明書進行，檢測儀器為芬蘭MK3-酶標儀。

1.2.3磁珠分選 采用MojoSortTMHuman CD8 T Cell Isolation Kit(BioLegend公司)分選外周血CD8+T細胞，具體步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.4抗原刺激 采用結(jié)核菌抗原Ag85B刺激實驗檢測TB患者和健康志愿者外周血CD8+CD161+T細胞產(chǎn)生IL-22、Perforin的能力。將以上分離的外周血單個核細胞(3×105個)采用Ag85B(10 μg/mL)刺激，同時加入CD28(1 μg/mL)和CD49d(1 μg/mL)共刺激分子。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱刺激6 h，PBS洗滌，分別加入CD3抗體、CD8抗體和CD161抗體室溫避光染色30 min，采用胞內(nèi)因子染色試劑盒(達科為生物技術(shù)股份有限公司)對IL-22、Perforin抗體進行胞內(nèi)染色，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。以上實驗設(shè)立對照組，對照組僅采用CD28(1 μg/mL)和CD49d(1 μg/mL)刺激。

2 結(jié) 果

2.1TB患者外周血MAIT細胞水平 TB患者外周血MAIT細胞水平[(3.15±2.21)%]明顯低于健康志愿者[(5.31±2.28)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.661,P<0.05)。痰涂片檢查結(jié)核菌陽性TB患者外周血MAIT細胞水平[(1.87±2.11)%]明顯低于陰性TB患者[(4.43±2.27)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.016,P<0.05)。常規(guī)化療藥物治療前TB患者外周血MAIT細胞水平[(2.04±2.19)%]明顯低于治療后TB患者[(4.26±2.23)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.543,P<0.05)。TB患者外周血MAIT細胞水平與患者性別、年齡均無關(guān)(P>0.05)。

2.2TB患者外周血血清IL-22水平 TB患者外周血血清IL-22水平(32.67±35.17)pg/mL明顯低于健康志愿者(55.18±30.14)pg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.919,P<0.05)。痰涂片檢查結(jié)核菌陽性TB患者外周血血清IL-22水平(19.55±36.68)pg/mL明顯低于陰性TB患者(45.79±34.16)pg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.584,P<0.05)。常規(guī)化療藥物治療前TB患者外周血血清IL-22水平(22.37±34.11)pg/mL明顯低于治療后TB患者(42.97±36.41)pg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.063,P<0.05)。TB患者外周血血清IL-22水平與患者性別、年齡均無關(guān)(P>0.05)。

2.3MAIT細胞和IL-22水平相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示TB患者外周血MAIT細胞和IL-22水平呈正相關(guān) (r=0.427,P<0.05)，見圖1。

圖1 MAIT細胞和IL-22水平相關(guān)性分析

2.4MAIT細胞產(chǎn)生細胞因子的能力分析 Ag85B刺激后TB患者和健康志愿者外周血MAIT細胞產(chǎn)生Perforin的能力與對照組比較均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A、B。Ag85B刺激后TB患者和健康志愿者外周血MAIT細胞產(chǎn)生IL-22水平無明顯差異(P>0.05)，見圖2C。

A：代表性流式圖；B：兩組Perforin水平比較；C：兩組IL-22水平比較

3 討 論

MAIT細胞是一群在進化上高度保守的T淋巴細胞，在外周血中MAIT細胞占總T細胞的 1%～10%，由于其可以激活表達Granzyme B、Perforin、IFN-γ、TNF-α等殺傷性細胞因子，從而構(gòu)成了固有免疫屏障的重要防線。近年來研究發(fā)現(xiàn)MAIT細胞在抵抗各種細菌感染中均發(fā)揮著重要的作用，例如肺炎克雷伯菌、痢疾志賀菌、土拉菌、卡介苗、和膿腫分支桿菌等[10-12]。大腸桿菌感染外周血單個核細胞后，MAIT細胞產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α均明顯低于對照組[13]。本研究發(fā)現(xiàn)TB患者外周血MAIT細胞水平明顯低于健康志愿者(P<0.05)，尤其是痰涂片檢查結(jié)核菌陽性患者外周血MAIT細胞水平較陰性患者更低(P<0.05)。另外，TB患者經(jīng)常規(guī)化療藥物治療后MAIT細胞水平明顯增高(P<0.05)，以上結(jié)果提示結(jié)核菌感染可能弱化了MAIT細胞功能，機體MAIT細胞減少可能促進了TB的發(fā)生、發(fā)展。此外，在這個過程中，本文亦發(fā)現(xiàn)TB患者外周血IL-22水平亦明顯下降，并與患者結(jié)核菌活躍度密切相關(guān)。特別是，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示TB患者外周血MAIT細胞水平和IL-22水平呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，提示二者關(guān)系密切，可能共同介導(dǎo)了TB的發(fā)生、發(fā)展。為了進一步驗證結(jié)核菌感染是否直接影響MAIT細胞功能，本文采用結(jié)核菌抗原Ag85B刺激分選的CD8+T細胞，并采用流式細胞術(shù)檢測MAIT細胞產(chǎn)生Perforin和IL-22的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ag85B刺激之后TB患者和健康志愿者外周血MAIT細胞產(chǎn)生Perforin的能力與對照組比較明顯降低(P<0.05)，提示TB患者MAIT細胞激活殺傷性細胞因子的能力可能受損。

IL-22是在2000年發(fā)現(xiàn)的細胞因子，在機體中由Th22、Th17、Th1、NK22、γδT及MAIT等細胞分泌[14-15]，它在自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病和感染性疾病中發(fā)揮著重要作用，在銀屑病、異位性皮炎和潰瘍性結(jié)腸炎患者中作用更加突出[16]。IL-22是T細胞膜表面成熟的細胞因子，其陽性細胞可通過產(chǎn)生效應(yīng)分子，發(fā)揮抗結(jié)核菌作用，抑制T細胞IL-22表達，巨噬細胞抗結(jié)核作用將會被抑制。本研究發(fā)現(xiàn)Ag85B刺激后，TB患者和健康志愿者外周血MAIT細胞產(chǎn)生IL-22水平無明顯差異(P>0.05)，提示結(jié)核菌抗原可能通過完全不同的機制調(diào)節(jié)了MAIT細胞Perforin和IL-22表達，然而確切的機制還有待進一步研究。

綜上所述本文作出以下推測：(1)TB患者MAIT細胞水平降低，尤其與患者結(jié)核菌活躍狀態(tài)密切相關(guān)。(2)當機體感染結(jié)核菌后，MAIT細胞功能受到明顯影響，尤其是產(chǎn)生Perforin的能力明顯降低。(3)MAIT和IL-22在抗肺結(jié)核免疫過程中可能起著協(xié)同作用。因此，MAIT細胞和IL-22動態(tài)變化可反映肺結(jié)核的病情發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，具有成為肺結(jié)核患者臨床診斷依據(jù)的可能。盡管MAIT細胞和IL-22在結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展中可能具有一定的作用，但在抗結(jié)核免疫中各亞群細胞與IL-22的協(xié)同機制尚不明確，仍需進一步研究。