王春燕， 馮凡，， 鞏企霞， 束瑜， 萬晟霞， 趙晶， 徐平， 錢進軍

(1. 江蘇大學醫(yī)學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

帕金森病最重要的病理性標志為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的選擇性丟失，在殘存的神經(jīng)元內(nèi)可見聚集的路易小體及α-突觸核蛋白(α-syn)多聚體，導致紋狀體內(nèi)多巴胺水平的下降。對于多巴胺能神經(jīng)元丟失的具體機制尚未十分清楚，但目前認為α-syn多聚體含量的增高或蛋白過表達可導致帕金森病，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集(如α-syn)[1]成為帕金森病發(fā)病機制的核心假說。過表達或者聚集的α-syn蛋白可對細胞產(chǎn)生毒性作用，造成線粒體功能障礙[2]及氧化應激[3]等損傷，最終導致神經(jīng)元凋亡。自噬途徑在參與蛋白質(zhì)寡聚體及多聚體降解的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。帕金森病患者自噬功能受損[5-6]，導致溶酶體介導的α-syn多聚體的清除水平降低。利福平是一種半合成廣譜抗生素，具有神經(jīng)保護作用。在魚藤酮誘導的帕金森病細胞模型中，利福平可減少多巴胺能神經(jīng)元細胞內(nèi)α-syn及其多聚體的含量[7]。利福平是否可以通過調(diào)節(jié)細胞自噬以增加α-syn多聚體的清除，從而降低神經(jīng)元的凋亡率？基于此，本課題小組展開以下實驗。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞系和主要儀器

人骨髓神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞由中國科學院上海生命科學研究院營養(yǎng)所惠贈；DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；二甲基亞砜、魚藤酮、利福平、雷帕霉素、氯喹和MTT(美國Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(美國BD公司)；兔抗人α-syn(美國Abcam公司)；兔抗人Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、β-肌動蛋白及HRP標記的羊抗兔抗體(美國Proteintech公司)。

FACS Calibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；Ti-S倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將SH-SY5細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合液的DMEM-F12培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24 h換液1次。當細胞密度達90%時，將其消化并以1∶3比例傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 MTT實驗檢測各組細胞活力

1.3.1 選取魚藤酮有效濃度 將細胞以1×105密度接種于96孔板，每孔100 μL，孵育24 h；棄上清液，每孔分別加入0、5、10、25 μmol/L魚藤酮溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h；棄上層液體，每孔加入100 μL 二甲基亞砜，搖勻直至紫色化合物全部溶解；酶標儀490 nm處測定光密度(D)值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(給藥組D值/空白對照組D值)×100%。所有給藥組每個濃度設(shè)置6個復孔。

1.3.2 選取利福平最佳濃度 按“1.3.1”中方法接種細胞，加入5 μmol/L魚藤酮作用于細胞24 h；棄上清液，再分別加入0、50、150、300 μmol/L利福平繼續(xù)處理細胞24 h；按照上述MTT法測定各組細胞光密度(D)值并計算細胞存活率。

1.3.3 選取雷帕霉素和氯喹最佳濃度 按上述“1.3.1”中方法接種細胞，分別將10、100、1 000 nmol/L雷帕霉素和1、10、100 μmol/L氯喹單獨作用于SH-SY5細胞，孵育2 h；MTT法測定各組D值并計算細胞存活率。

1.4 實驗分組及給藥

將細胞分為4組。對照組：不加任何藥物；魚藤酮組：用5 μmol/L魚藤酮處理細胞，24 h后棄上清液，改為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；利福平+魚藤酮組：5 μmol/L魚藤酮處理細胞24 h，棄上清液，再用150 μmol/L利福平處理細胞24 h；利福平組：用150 μmol/L利福平單獨處理細胞24 h。提取各組細胞蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞內(nèi)自噬標志性蛋白Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/Ⅰ水平。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

取“1.4”中分組細胞，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，各組樣品加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞；加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI染色試劑，輕輕混勻后避光、室溫反應10 min；加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞；在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。每組重復3次。

1.6 雷帕霉素和氯喹最佳作用時間篩選

選取10 nmol/L雷帕霉素和10 μmol/L氯喹，分別作用于“1.2”中細胞0.5、1、2 h，提取細胞內(nèi)總蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞內(nèi)Beclin-1的表達水平。

將雷帕霉素(10 nmol/L，2 h)、氯喹(10 μmol/L，1 h)分別作用于“1.4”分組中的魚藤酮組和利福平+魚藤酮組細胞，蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞內(nèi)α-syn多聚體表達水平。

將0、0.2、1、5 μmol/L魚藤酮分別作用于“1.2”中的細胞24 h，檢測細胞內(nèi)α-syn多聚體及Beclin-1表達水平。

將魚藤酮(5 μmol/L，24 h)、氯喹(10 μmol/L，1 h)、雷帕霉素(10 nmol/L，2 h)分別作用于“1.2”中細胞，檢測細胞內(nèi)α-syn多聚體及Beclin-1表達。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測α-syn多聚體水平和自噬相關(guān)蛋白的表達

提取蛋白，BCA蛋白定量法測蛋白濃度，制備濃縮膠和分離膠，LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白適用12%分離膠，其余各蛋白均適用10%分離膠。將等量的各蛋白樣本(約80 μg)分別上樣，行SDS-PAGE；濕法電轉(zhuǎn)膜(250 mA，40 min)；將PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；用1×TBST洗膜3次，5 min/次；加入α-syn、Beclin-1、p62、LC3、β-肌動蛋白抗體(稀釋比均為1 ∶1 000) 4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，10 min/次；加入二抗(稀釋比均為1 ∶6 000)室溫孵育1.5 h；洗膜后在暗室中加入ECL曝光液，經(jīng)成像系統(tǒng)顯影。采用Image J軟件處理圖像，目的蛋白相對表達量為目的條帶與內(nèi)參β-肌動蛋白的光密度比值。每組實驗至少重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各藥物的最佳作用條件

2.1.1 魚藤酮有效濃度與利福平最佳濃度的確定 與對照組相比，5、10、25 μmol/L魚藤酮處理組SH-SY5Y細胞存活率明顯降低(P均<0.01)，綜合考慮選取5 μmol/L魚藤酮為起始有效濃度。與魚藤酮組相比，50、150、300 μmol/L利福平組細胞存活率均有增高趨勢，但150 μmol/L組差異有統(tǒng)計學意義(t=5.0，P<0.01)，故選擇150 μmol/L利福平作為最佳實驗濃度。見圖1。

圖1 經(jīng)不同濃度魚藤酮和利福平處理24 h后的細胞存活率

2.1.2 自噬調(diào)節(jié)劑雷帕霉素和氯喹最佳濃度與時間的確定 與對照組相比，10 nmol/L雷帕霉素和10 μmol/L氯喹細胞存活率不受影響(雷帕霉素：t=1.27，氯喹：t=2.72，P均>0.05)。見圖2。

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，氯喹1 h組Beclin-1表達水平明顯降低(t=18.84，P<0.01)，雷帕霉素2 h組Beclin-1表達水平明顯提高(t=25.78，P<0.01)。故后續(xù)實驗中選用雷帕霉素10 nmol/L作用2 h，氯喹10 μmol/L作用1 h作為自噬促進劑雷帕霉素和自噬抑制劑氯喹預處理的最佳濃度和時間。見圖3。

圖2 MTT法檢測各組細胞的存活率

2.2 自噬受抑制時SH-SY5Y細胞內(nèi)α-syn多聚體含量增加

結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度魚藤酮組SH-SY5Y細胞內(nèi)Beclin-1表達明顯減少(P均<0.01)，且魚藤酮對Beclin-1和α-syn多聚體含量的影響呈濃度依賴性，較高濃度魚藤酮(5 μmol/L)使SH-SY5Y細胞內(nèi)Beclin-1表達明顯減少(t=27.04，P<0.01)，α-syn多聚體表達明顯增加(t=13.81，P<0.01)。 與對照組相比，氯喹組Beclin-1表達明顯減少(t=4.08，P<0.05)，α-syn蛋白多聚體含量顯著升高(t=12.82，P<0.01)。見圖4。

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測Beclin-1蛋白的表達

a：P<0.01，b：P<0.05，與對照組比較

2.3 利福平降低帕金森病模型細胞的凋亡率

流式細胞檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，魚藤酮組凋亡率明顯升高(t=10.0，P<0.05)；與魚藤酮組相比，利福平+魚藤酮組凋亡率降低(t=7.81，P<0.05)。見圖5。

2.4 利福平降低帕金森病細胞模型α-syn多聚體的含量

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，魚藤酮組α-syn多聚體含量明顯上升(t=4.66，P<0.01)；與魚藤酮組相比，利福平+魚藤酮組α-syn多聚體含量顯著降低(t=11.35，P<0.01)。見圖6。

2.5 利福平通過促進自噬降低α-syn多聚體水平

蛋白印跡結(jié)果顯示，與魚藤酮組相比，利福平+魚藤酮組Beclin-1表達顯著升高，p62表達顯著下降，LC3-Ⅱ/Ⅰ提高(Beclin-1：t=22.33，p62：t=9.17，LC3-Ⅱ/Ⅰ：t=12.4，P均<0.01)。與利福平+魚藤酮組相比，氯喹預處理組α-syn多聚體表達水平明顯增加(t=30.15，P<0.01)。見圖7。

b：P<0.05

a：P<0.01

3 討論

帕金森病的主要發(fā)病機制包括α-syn異常沉積、氧化應激、自噬損傷、免疫異常、炎癥反應和細胞凋亡等[8]，其中α-syn異常沉積、氧化應激等均可在不同層面導致細胞凋亡。神經(jīng)退行性疾病在自噬的不同階段受損，可以通過多種方式觸發(fā)神經(jīng)細胞死亡。當自噬體清除和底物降解步驟受損時，噬溶酶體會積累突變體和氧化蛋白、蛋白質(zhì)寡聚體及蛋白質(zhì)多聚體、受損的細胞器和其他未完全消化的產(chǎn)物，從而增加溶酶體膜的通透性，導致水解酶釋放到細胞質(zhì)中。溶酶體組織蛋白酶釋放可通過線粒體釋放的細胞色素c激活凋亡級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡[9]。

大多數(shù)情況下，自噬促進細胞生存，意味著自噬傾向于抗細胞凋亡。通常在低劑量損傷時，自噬的細胞保護功能優(yōu)于其潛在的細胞毒性作用[10]。研究顯示，在帕金森病大鼠模型和PC12細胞中[11]，魚藤酮能夠誘導自噬底物p62和α-syn聚集，損傷溶酶體膜的完整性，擾亂自噬流，促進細胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度魚藤酮作用于SH-SY5Y細胞后，p62和α-syn多聚體水平升高，證實了魚藤酮對細胞自噬的損害，說明在多巴胺能神經(jīng)元神經(jīng)退行性病變過程中自噬功能受抑制，干擾了α-syn蛋白多聚體的降解。

在脂多糖誘導的帕金森病炎癥損傷模型中[12]，利福平通過抑制TLR-4通路減少促炎因子的釋放最終減少細胞凋亡。

利福平通過減少活性氧釋放，避免線粒體損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，亦可降低神經(jīng)元凋亡率[13]。本實驗采用魚藤酮誘導帕金森病細胞模型，當利福平為150 μmol/L時，不僅能最大限度促進細胞生存，還能有效減少多巴胺能神經(jīng)元凋亡，具體機制有待進一步研究。在阿爾茲海默癥動物模型中[14]，17月齡APPOSK小鼠每天口服利福平0.5 mg，1個月后β-淀粉樣蛋白的積累明顯減少；13月齡Tg2576小鼠每日口服利福平0.5 mg，1個月后，利福平以劑量依賴性方式減少α-淀粉樣蛋白寡聚體積累和tau過度磷酸化，減少突觸喪失以及抑制小膠質(zhì)細胞激活化。本研究中利福平有效降低了魚藤酮組α-syn多聚體水平，由此推測，利福平可能在阿爾茲海默癥動物模型和帕金森病細胞模型中通過減少病理蛋白的積累，發(fā)揮抑制神經(jīng)元凋亡的作用。

圖7 蛋白質(zhì)印跡檢測各組細胞內(nèi)α-syn多聚體及自噬相關(guān)蛋白表達水平

在帕金森病炎癥細胞模型中，與未預處理的細胞相比，利福平預處理的BV2細胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ表達明顯增高，溶酶體與線粒體共定位增加，表明利福平可通過自噬途徑發(fā)揮抗炎作用[15]。本研究結(jié)果顯示，利福平可有效提高Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達，減少自噬底物p62和α-syn多聚體表達，且自噬抑制劑氯喹部分消除了利福平預處理的神經(jīng)保護作用，提示利福平可能通過促進自噬加強α-syn蛋白多聚體的清除，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，最終減少神經(jīng)元凋亡。

對于利福平神經(jīng)保護作用的研究，本課題小組目前局限于細胞層面，未能很好地展現(xiàn)藥物在生物體內(nèi)復雜的代謝反應，下一步擬進行動物實驗的設(shè)計和研究。自噬是一個動態(tài)的反應過程，在后續(xù)實驗中，擬使用透射電鏡、免疫熒光分析等技術(shù)全方位捕捉自噬流的變化，研究利福平在自噬泡形成的起始、延伸、融合等過程中的表現(xiàn)及其與氧化應激、細胞凋亡之間的關(guān)系。

綜上所述，本研究初步證實在帕金森病細胞模型中，利福平能減少魚藤酮誘導的多巴胺能神經(jīng)元凋亡，且可能通過促進細胞自噬降低α-syn多聚體水平。