朱小紅 胡穎君

結(jié)核病是一種嚴(yán)重的傳染性疾病, 而且近些年來愈漸呈發(fā)病率增高的態(tài)勢(shì), 若該病能早期確診, 對(duì)患者預(yù)后和轉(zhuǎn)歸具有重要意義。以往臨床在對(duì)結(jié)核病患者的檢驗(yàn)上所用的常規(guī)痰涂片抗酸染色法, 受到結(jié)核病病原菌陽性檢出率低的影響, 對(duì)結(jié)核病的早期診斷帶來一定阻礙。實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)有著操作便捷、靈敏度和特異度高的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn), 在臨床上的應(yīng)用也已經(jīng)取得了很好反響。現(xiàn)具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月～2017年6月本院收治的100例結(jié)核病患者作為研究對(duì)象, 排除合并有嚴(yán)重的心、臟等重要器官疾病者。其中, 男50例, 女50例；年齡20～55歲,平均年齡(38.2±5.7)歲；病程15 d～7個(gè)月, 平均病程(2.7±1.5)個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)法 首先, 提取DNA。將取得的痰液標(biāo)本收集到試管當(dāng)中, 加入4%氫氧化鈉溶液, 均勻搖混, 在常溫的環(huán)境下靜態(tài)放置20 min, 直至標(biāo)本出現(xiàn)液化, 再加入1 ml的混合液, 持續(xù)進(jìn)行5 min的離心處理, 將上清液去除, 舍棄離心管里的沉淀物之后, 加進(jìn)1 ml的0.9%氯化鈉溶液, 再次進(jìn)行5 min的離心處理, 并取出沉淀物, 最后將50 μl的DNA提取液加入其中, 均勻的搖混之后, 在100℃的環(huán)境下放置10 min, 10 min后持續(xù)離心5 min, 放到-20℃的條件下保存, 待檢。其次, PCR擴(kuò)增。將以上經(jīng)過處理的樣品上清液提取出2 μl, 加到PCR反應(yīng)管中, 進(jìn)行1 min的離心處理, 放到儀器樣品槽中。93℃下2 min, 55℃下45 s、65℃下60 s, 上述為10個(gè)循環(huán)；93℃下30 s、55℃下45 s, 上述為30個(gè)循環(huán)。設(shè)定好陰性質(zhì)控品作為陽性定量的參考數(shù)據(jù)。結(jié)合FQ-PCR軟件閥值, 獲得一條呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增曲線。當(dāng)擴(kuò)增曲線Ct值≤36時(shí), 確定為陽性病例；當(dāng)Ct值＞40, 確定為陰性病例；若Ct值介于37～40, 那么再次進(jìn)行測(cè)定, 并以再次測(cè)定獲得的結(jié)果作為評(píng)判依據(jù), 如果再次檢驗(yàn)所得Ct值還是介于 37～40, 則判定為陰性［1］。

1.2.2 涂片抗酸染色法 獲取患者的痰液標(biāo)本進(jìn)行涂片,至干燥之后加以固定, 進(jìn)行Z-N染色處理, 采用鏡檢對(duì)所得染色結(jié)果加以觀察。

1.3 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計(jì)并比較實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)法、涂片抗酸染色法對(duì)疑似結(jié)核病患者檢驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)法檢測(cè)陽性例數(shù)為81例, 陽性檢出率為81.0%；涂片抗酸染色法檢測(cè)陽性例數(shù)38例, 陽性檢查率為38.0%；實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)法的陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.365, P=0.000＜0.05)。見表1。

表1 兩種不同檢驗(yàn)方法的檢出結(jié)果比較［n(%)］

3 討論

結(jié)核病屬于一種傳染性的嚴(yán)重病癥, 是由結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)發(fā)生的, 當(dāng)發(fā)生感染之后, 便可侵入到人體全身的各個(gè)器官當(dāng)中, 臨床最常見的一種結(jié)核病便是肺結(jié)核病。結(jié)核病主要是通過呼吸道感染傳染, 臨床上以飛沫感染方式最為常見。疑似患者前來就診時(shí), 臨床多是結(jié)合其既往病史、影像學(xué)檢查結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等作出最終的明確診斷。

診斷結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室檢查方法比較多, 例如痰涂片抗酸染色法、痰培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)方法等。其中痰涂片抗酸染色法雖然通過鏡檢能夠直接觀察到分枝桿菌, 但是卻易于受到痰液標(biāo)本質(zhì)量、檢驗(yàn)工作者主觀因素的影響而降低檢出陽性率, 首先是非特異性, 有100多種的分枝桿菌同樣是呈抗酸染色陽性的；其次便是抗酸桿菌的形態(tài)和大小變化均較大, 會(huì)使得結(jié)果判斷出現(xiàn)差異；最后便是因?yàn)槭艿骄w分布不均的影響, 人為判讀結(jié)果時(shí), 會(huì)由于缺乏規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化而造成客觀漏診［2］。上述這些問題均會(huì)給結(jié)核病的確診帶來很大難度。

另外, 就實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)方法來看, 是近幾年來新興并被廣泛使用的一種基因診斷技術(shù), 它是在反應(yīng)體系當(dāng)中加入了1個(gè)熒光標(biāo)記探針, 繼而在檢驗(yàn)的過程當(dāng)中, 充分借助Taq酶外切核酸酶活性促進(jìn)熒光信號(hào)的釋放, 于擴(kuò)增的這一過程當(dāng)中, 每當(dāng)模板復(fù)制1次, 便可以釋放出1個(gè)熒光信號(hào),而基于對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)弱度的判斷, 便可精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)對(duì)模板的定量［3］。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到對(duì)各種病原體的核酸檢測(cè)當(dāng)中, 其實(shí)驗(yàn)室操作不僅便捷, 而且具有檢驗(yàn)高效的優(yōu)勢(shì),整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程僅控制在3 h之內(nèi)便可完成, 這可以說是在很大程度上縮短了實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間, 不僅有利于提高陽性檢出率, 而且在此基礎(chǔ)上還能盡早為臨床提供以精準(zhǔn)的檢驗(yàn)結(jié)果, 給患者及時(shí)的開展早期治療提供了便利條件。

結(jié)合本次研究結(jié)果來看, 實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)法的陽性檢出率為81.0%, 明顯高于涂片抗酸染色法的38.0%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.365, P=0.000＜0.05)。由上述結(jié)果可知, 涂片抗酸染色法陽性檢出率比較低, 這是由于在使用涂片抗酸染色法進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí), 可能會(huì)由于受到痰液標(biāo)本質(zhì)量以及檢驗(yàn)工作者主觀因素的影響, 導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果陽性率偏低。

另外需要強(qiáng)調(diào)的是, 采用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)于那些含有結(jié)核菌量比較低的樣本有著極高的應(yīng)用價(jià)值, 其中采用擴(kuò)增技術(shù)能明顯提高檢驗(yàn)的精準(zhǔn)程度, 無論是在尿液還是在胸腹水的檢驗(yàn)當(dāng)中, 均能夠提高分枝桿菌的陽性檢出率［4,5］。而且因?yàn)閷?shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)技術(shù)是使用閉關(guān)操作,所有耗材皆為一次性使用, 實(shí)現(xiàn)了專區(qū)專用, 因此這也有利于降低實(shí)驗(yàn)過程中的標(biāo)本污染率, 從而能夠進(jìn)一步提高診斷的準(zhǔn)確率［6-8］。

綜上所述, 采用實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)法對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行臨床診斷, 其陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法, 可廣泛應(yīng)用到臨床實(shí)踐中, 對(duì)結(jié)核病的病理診斷有著重要輔助作用。