董大偉，王曉慧，蘇 葛，馬 偉，楊建梅，葉 紅

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

大曲通過(guò)自然接種和發(fā)酵，富集了大量有益于釀酒的微生物、各種酶類以及香味物質(zhì)，在釀酒過(guò)程中起到驅(qū)動(dòng)糖化、發(fā)酵和生香的重要作用。也正是如此，才有了俗語(yǔ)“曲為酒之骨”“曲定酒型”之說(shuō)。為了確保和提升原酒品質(zhì)，各酒企都制訂了相應(yīng)的大曲質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，但都僅限于出房曲。大曲在用于釀酒生產(chǎn)前，必須經(jīng)過(guò)3～6個(gè)月的存儲(chǔ)，減少乳酸菌、乙酸菌等產(chǎn)酸細(xì)菌的數(shù)量，使入池酒醅能夠符合前緩、中挺、后緩落的發(fā)酵工藝要求，達(dá)到增加酒體綿柔感的目的[1-2]，可見大曲存儲(chǔ)后的質(zhì)量對(duì)釀酒影響更為直接。

大曲在存儲(chǔ)過(guò)程中受存儲(chǔ)條件的影響，會(huì)出現(xiàn)斷面發(fā)暗、霉變、裂縫、脫殼以及理化指標(biāo)波動(dòng)等現(xiàn)象，還有可能對(duì)釀酒以及大曲自身質(zhì)量帶來(lái)影響，多數(shù)酒企都無(wú)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)此進(jìn)行科學(xué)管理和控制。現(xiàn)用曲（為方便閱讀，以下將存儲(chǔ)后的大曲稱為現(xiàn)用曲）的感官表象與出房曲相比有較大不同，如：斷面多數(shù)呈暗灰色、黑褐色，易出現(xiàn)裂縫、脫殼、霉變，蟲害嚴(yán)重等。為了對(duì)這些表象進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，達(dá)到全面管控的目的，本文以江蘇洋河酒廠的中高溫大曲為對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)現(xiàn)用曲感官質(zhì)量進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大曲樣品：不同表象的洋河中高溫現(xiàn)用曲。

5 g 1#斷面樣品：取自斷面呈灰白色、泡氣性較好的曲塊的斷面部分。

5 g 2#斷面樣品：取自斷面呈暗灰色、淺褐色、欠泡氣的曲塊的斷面部分。

5 g 3#斷面樣品：取自斷面呈黑褐色、有生心、窩水的曲塊的斷面部分。

5 g 4#裂縫樣品：取自干裂曲塊的裂縫部分。

5 g 5#曲殼樣品：取自大曲樣品的曲殼部分。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Miseq PE300平臺(tái)、美國(guó)ABI GeneAmp?9700型PCR儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

將1.1中1#～5#樣品分別進(jìn)行DNA提取，將樣品粉碎后加入到含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì),再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì),得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。

1.3.2 基因組DNA抽提

待基因組DNA抽提完成后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提和收集的基因組DNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。隨機(jī)抽取樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確保在較低循環(huán)數(shù)中能夠?qū)⒔^大多數(shù)樣本擴(kuò)增出適宜濃度的產(chǎn)物。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；每個(gè)樣本3個(gè)平行樣，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)混合后的PCR產(chǎn)物，使用Axy-PrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3.4 熒光定量

根據(jù)電泳的定量結(jié)果，使用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，之后根據(jù)樣本的測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.3.5 Miseq文庫(kù)構(gòu)建

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

1.3.6 Miseq測(cè)序

(1)DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上。

(2)另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋(bridge)”。

(3)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇。

(4)DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈。

(5)加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基。

(6)用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。

(7)將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3'端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。

(8)統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.3.7 生物信息分析

Miseq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)量控制和過(guò)濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)。綜合分析可以進(jìn)行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 現(xiàn)用曲香味的分析

現(xiàn)用曲粉碎后與酒醅混勻入池發(fā)酵，經(jīng)過(guò)發(fā)酵和蒸餾后，曲自身的香味會(huì)帶入酒體，與酒體中的其他香味物質(zhì)結(jié)合，形成了白酒中綿厚怡人的復(fù)合香氣。所以，大曲的曲香味也是衡量大曲感官質(zhì)量的重要指標(biāo)。現(xiàn)用曲與出房曲相比，曲香味有著明顯的差別。剛出房的大曲香氣濃郁，但香味較雜，混有糧食味；經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的存儲(chǔ)通風(fēng)排潮后，現(xiàn)用曲中的雜味逐漸消失，曲香更加純正、濃郁。但受霉變和蟲害影響，有的曲塊可能存在霉味、餿味和蟲屎味等?，F(xiàn)用曲存在這些現(xiàn)象是由于儲(chǔ)存管理不當(dāng)，未做好通風(fēng)排潮工作導(dǎo)致。所以現(xiàn)用曲香味指標(biāo)的評(píng)價(jià)應(yīng)增加對(duì)以上異雜味的管控。我們根據(jù)分析形成表1現(xiàn)用曲香味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 現(xiàn)用曲香味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.2 現(xiàn)用曲斷面的分析

將1.1中1#、2#、3#斷面樣品按照1.3方法進(jìn)行高通量測(cè)序，并對(duì)分析報(bào)告中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組分（圖1、圖2）進(jìn)行分析。斷面群落相對(duì)豐度情況見表2、表3。

圖1 斷面群落結(jié)構(gòu)組分圖（細(xì)菌）

由表2可知，3個(gè)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差別較大，1#斷面樣品有益細(xì)菌占比最高，約93%，包括高溫放線菌屬、魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、（乳酸）片球菌屬、糖多孢菌屬、克羅彭斯特菌屬等，其中高溫放線菌屬占比約78%，能夠起到脫臭生香的作用[3]，優(yōu)勢(shì)菌種明顯，反映出斷面呈灰白色、泡氣性較好的曲塊不僅糖化發(fā)酵作用強(qiáng)，同時(shí)也具備較優(yōu)的生香等功能；2#斷面樣品有益細(xì)菌僅占約35.4%；3#斷面樣品優(yōu)勢(shì)菌種不明顯，其中乳酸菌類偏多，且雜菌種類較多，包括葡萄球菌屬、腸桿菌屬、腸道菌屬、藍(lán)細(xì)菌屬等。斷面呈暗灰色、淺褐色、欠泡氣的曲塊中有益菌占比較少，而斷面呈黑褐色、有生心、窩水的曲塊中雜菌較多，導(dǎo)致曲塊糖化發(fā)酵功能不穩(wěn)定。

圖2 斷面群落結(jié)構(gòu)組分圖（真菌）

表2 斷面群落相對(duì)豐度占比（細(xì)菌) (%)

由表3可知，3個(gè)樣品真菌群落結(jié)構(gòu)基本類似，相對(duì)豐度占比有一定差別。其中熱子囊菌屬的相對(duì)豐度在各樣品中占比均最大，應(yīng)是根霉屬類，曲霉屬與熱子囊菌屬相對(duì)豐度占比呈此消彼長(zhǎng)的規(guī)律。根霉屬和曲霉屬中的有益菌功能類似，均主要起糖化作用。從真菌屬層面分析，還無(wú)法準(zhǔn)確鑒別3個(gè)樣品的功能優(yōu)劣。由于目前黃曲霉和青霉的研究較多，菌種的功能和危害性已有定性，這里不做進(jìn)一步分析。

表3 斷面群落相對(duì)豐度占比（真菌） (%)

綜合分析認(rèn)為，斷面呈灰白色、泡氣性較好的曲塊不僅糖化發(fā)酵作用強(qiáng)，同時(shí)也具備較優(yōu)的生香等功能，即依據(jù)大曲斷面菌絲顏色、泡氣性以及斷面生心、窩水、霉變等缺陷，能夠推斷出其功能性的優(yōu)劣，驗(yàn)證了傳統(tǒng)感官判定經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)性。根據(jù)內(nèi)容分析，現(xiàn)用曲斷面評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表4。

表4 現(xiàn)用曲斷面評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.3 現(xiàn)用曲裂縫和脫殼的分析

曲塊在儲(chǔ)存過(guò)程中水分不斷散失，受物理作用容易出現(xiàn)裂縫和脫殼的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在現(xiàn)用曲中極為常見。為了研究裂縫和脫殼的影響性，我們采集了1.1中的4#裂縫樣品，進(jìn)行高通量測(cè)序研究（見圖3、表5）。

由表5可知，4#裂縫樣品中含有高溫放線菌、魏斯氏菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、片球菌屬、糖多孢菌屬、短桿菌屬等有益菌占比約63%，其中高溫放線菌占比約39%，也存在雜菌過(guò)多的現(xiàn)象，群落結(jié)構(gòu)好于3#斷面樣品；我們認(rèn)為，裂縫的影響主要為雜菌感染，有益菌占比偏低。雜菌感染是由空氣中的微生物附著生長(zhǎng)于曲塊裂縫表面造成。曲塊若出現(xiàn)脫殼現(xiàn)象也會(huì)引起相應(yīng)問題。因此，當(dāng)現(xiàn)用曲出現(xiàn)裂縫或脫殼現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)將以上影響進(jìn)行考量。

圖3 裂縫處群落結(jié)構(gòu)組分圖（細(xì)菌）

表5 裂縫群落相對(duì)豐度占比（細(xì)菌）

2.4 現(xiàn)用曲曲殼的分析

為了更好的分析曲殼厚度對(duì)質(zhì)量的影響，我們采集了大曲樣品的曲殼部分進(jìn)行基因測(cè)序（5#曲殼樣品5 g），但由于提取的DNA濃度較低，無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增和相關(guān)測(cè)序工作?？梢娗鷫K的曲殼、火圈、斷面、曲心等部分中，曲殼的微生物含量最低。曲塊的主要功能是為釀酒提供酶類、菌源和香味成分，為了對(duì)曲殼進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)曲塊各部分進(jìn)行了分析，結(jié)果見表6、表7。

表6 曲塊各部分的香味品評(píng)

從曲殼的測(cè)序、香味品評(píng)和理化檢測(cè)[4]結(jié)果可以看出，曲殼的香味不足，具備較強(qiáng)的糖化和分解蛋白質(zhì)能力，但曲殼中的糖化酶和蛋白酶主要來(lái)源于糧食種子自身而不是主要由微生物產(chǎn)生。我們對(duì)曲殼的分析結(jié)果：具備一定的糖化、發(fā)酵、分解功能，但缺乏菌源和香味成分，釀酒作用相較于火圈和斷面較弱，所以現(xiàn)用曲的曲殼不宜過(guò)厚。

2.5 現(xiàn)用曲蟲害的分析

夏季天氣炎熱，曲蟲會(huì)大量繁殖，給白酒企業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。據(jù)統(tǒng)計(jì),夏季曲蟲能吃掉大曲重量的30%～50%，造成釀酒用曲量的減少，不僅如此，還會(huì)造成曲塊糖化力、液化力、微生物總數(shù)的下降。蟲蛀嚴(yán)重的曲塊還會(huì)影響到大曲的曲香，破壞大曲的表面微生物群落結(jié)構(gòu)及酶系，嚴(yán)重影響了大曲的質(zhì)量。夏季曲蟲漫天飛舞，對(duì)環(huán)境衛(wèi)生和工人身體健康也帶來(lái)不利的影響[5]。所以對(duì)現(xiàn)用曲的質(zhì)量評(píng)價(jià)應(yīng)增加蟲害控制要求。

2.6 現(xiàn)用曲感官標(biāo)準(zhǔn)

綜合以上分析內(nèi)容，我們制定了現(xiàn)用曲感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（60分制），評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表8。

表7 曲塊各部分理化檢測(cè)結(jié)果

表8 現(xiàn)用曲感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)論

3.1 存儲(chǔ)期過(guò)后，受環(huán)境和自身影響，曲塊呈現(xiàn)出不同的感官表象，我們可以通過(guò)對(duì)現(xiàn)用曲感官的觀察，直觀地了解曲塊的質(zhì)量情況，找出曲塊間的質(zhì)量差異。

3.2 本文對(duì)大曲的香味、斷面、裂縫、脫殼、曲殼、蟲害等感官進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，可供釀酒行業(yè)制定現(xiàn)用曲感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)作為借鑒。

3.3 本文制定了現(xiàn)用曲感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（表8），僅供行業(yè)參考。