周榆林，陳 劍，鐘明葉，陳夢(mèng)圓，蔡雪梅，李志軍，羅愛(ài)民

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065； 2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

中國(guó)白酒主要以香味獨(dú)特、酒體醇厚、優(yōu)雅細(xì)膩、空杯留香等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-3]。微生物在傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過(guò)程中對(duì)白酒的品質(zhì)、風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用[4]，對(duì)其研究具有極高的理論和應(yīng)用價(jià)值。貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所采用先進(jìn)的微生物培養(yǎng)和應(yīng)用技術(shù)，用麩皮接種純菌種發(fā)酵，并引入釀造工藝中，這是在國(guó)內(nèi)首次將細(xì)菌麩曲應(yīng)用到醬香型白酒的生產(chǎn)中[5]。滕巍等[6]從大曲中篩選得到1株高產(chǎn)乙酸乙酯酯化酶的霉菌，為提高大曲中酯含量奠定了一定基礎(chǔ)。陳夢(mèng)圓等[7]將1株產(chǎn)酯香功能菌制成純種麩曲添加到酒醅中，顯著改善了酒醅的性質(zhì)。應(yīng)用純種微生物制成麩曲應(yīng)用到白酒的生產(chǎn)中，是以后科研工作的方向[8]。己酸乙酯作為濃香型白酒的特征香氣物質(zhì)[9]，其含量高低對(duì)白酒品質(zhì)有很大影響。酯化力是衡量大曲生酯生香能力的理化指標(biāo)[10]，也是反映大曲質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)之一。因此研究酯化酶活力較高的菌株，增加酒曲的酯化力，對(duì)于提高白酒酯香、改善酒質(zhì)、縮短發(fā)酵周期有著重要意義。

四川大學(xué)陳劍等[11]從醬香型酒糟中篩選得到1株耐酸產(chǎn)酯細(xì)菌ZP-28，此株細(xì)菌具有顯著耐高溫耐酸特性，且酯化力較高，將其應(yīng)用在麩曲中具有明顯改善麩曲品質(zhì)的作用。本課題在此基礎(chǔ)上以該菌株為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并利用活菌計(jì)數(shù)法和分光光度法兩種不同的方法測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量等培養(yǎng)條件對(duì)酯化力的影響，并在此基礎(chǔ)上采用正交法對(duì)上述發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)改進(jìn)制曲工藝，提高白酒酯香提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：從四川某酒廠的堆積成熟酒糟中分離篩選得到的1株耐酸產(chǎn)酯香細(xì)菌ZP-28，現(xiàn)保存于四川大學(xué)食品科學(xué)與新技術(shù)研究室。

試劑：本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的生化試劑均為分析純及以上級(jí)別，溶液由蒸餾水配制。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g。pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2，121℃、0.1MPa條件下滅菌20 min后，冷卻倒平板，備用。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2，121 ℃、0.1MPa條件下滅菌20 min后冷卻，備用。

麩皮培養(yǎng)基：麩皮和稻殼按照8∶2的比例混勻，加水拌勻，加水量為總質(zhì)量的65%，潤(rùn)糧2 h。結(jié)束后進(jìn)行蒸煮，將鍋放于電爐上加熱，待有水蒸汽冒出后開始計(jì)時(shí)1 h，每隔15 min將原料翻1次，以保證均勻性。蒸煮結(jié)束后，將原料按10%比例裝瓶，放入滅菌鍋內(nèi)，121℃高壓滅菌30 min。

儀器設(shè)備：MJ-250型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）、pHS-3C型酸度計(jì)（杭州奧力龍儀器有限公司）、SW-CJ-ID雙人單面超凈工作臺(tái)（江蘇凈化設(shè)備公司）、721紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備）、2720 thermal cycler PCR 儀（Applied Biosysterms）、DYCP-31 DN電泳槽(北京六一儀器廠)、DYY-5穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠)、FR980凝膠成像儀(上海復(fù)日科技儀器有限公司)、HC-2518R冷凍高速離心機(jī)(BBI)、3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析方法

酯化力測(cè)定：參照QB/T 4257—2011。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定方法

1.2.2.1 菌株DNA提取過(guò)程（1）稱取純種麩曲0.5 g，置于2 mL離心管中。（2）向離心管中加入1 mL裂解液，漩渦充分混勻。

（3）將離心管置于-20℃條件下冷凍40 min，取出后65℃水浴溶解。

（4）將離心管置于-20℃條件下冷凍20 min，取出后65℃水浴溶解。

（5）將離心管置于-20℃條件下冷凍15 min，取出后65℃加熱30 min。

（6）10000 r/min離心10 min，取上清液550 μL轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，應(yīng)避免吸到沉淀。

（7）向離心管中加入200 μL無(wú)水乙醇，漩渦瞬時(shí)混勻。

（8）按Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒的步驟提取。

（9）提取的DNA樣品于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增體系及程序

以細(xì)菌的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表1。引物序列如下：

表1 16S rDNA PCR擴(kuò)增體系

循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性94℃維持4 min，之后30個(gè)循環(huán)的94℃變性45 s、55℃退火45 s和72℃延伸1 min，再以72℃修復(fù)延伸10 min。

瓊脂糖凝膠電泳：PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)判斷是否為陽(yáng)性擴(kuò)增。樣品和Marker的上樣量為4 μL。設(shè)定電壓為150 V，電泳時(shí)間15 min。接通電極，PCR產(chǎn)物由陰極向陽(yáng)極移動(dòng)。電泳結(jié)束后用FR980凝膠成像儀觀察。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化和測(cè)序

成像觀察結(jié)束后，用干凈的手術(shù)刀片將含有目的片段的瓊脂糖凝膠塊切下，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，對(duì)含有目的DNA片段進(jìn)行純化回收，回收效率可達(dá)80%，該試劑盒的膜結(jié)合液中不含有干擾酶活性的碘化鈉。最后洗脫得到的DNA溶液置于-20℃下保存或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PCR產(chǎn)物用PCR引物直接測(cè)序。

1.2.2.4 序列比對(duì)方法

序列結(jié)果用NCBI在線工具Blast在Gene Bank內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對(duì)，并用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株ZP-28生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法

活菌計(jì)數(shù)法是將一定濃度的發(fā)酵菌液適當(dāng)稀釋后均勻涂布于平板上，培養(yǎng)一定時(shí)間后計(jì)量菌落數(shù)，繪制“培養(yǎng)時(shí)間-活菌數(shù)量”的關(guān)系圖?；罹?jì)數(shù)測(cè)定法步驟為，與生長(zhǎng)曲線法采用同一體系菌液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再涂布至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算每毫升菌液中的活菌數(shù)量。分光光度法則是根據(jù)菌懸液的透光量間接測(cè)定細(xì)菌的濃度，因?yàn)榧?xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比，可以用吸光度反映菌濃度。選擇在37℃溫度培養(yǎng)條件下，測(cè)定ZP-28號(hào)菌株在LB培養(yǎng)基中吸光值變化曲線，以未接種的培養(yǎng)基為空白樣，每隔1 h吸取3 mL培養(yǎng)基以進(jìn)行OD值測(cè)定，并做活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，可以判斷菌體生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

選取培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和接種量3因素考察對(duì)酯化力的影響。

1.2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酯化力的影響

在37℃，3%接種量條件下，研究培養(yǎng)時(shí)間的影響，分別在48 h、60 h、72 h、84 h 4個(gè)培養(yǎng)時(shí)間下測(cè)定酯化力的大小，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎測(cè)酯化力。每個(gè)時(shí)間做3個(gè)平行，重復(fù)3組實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 接種量對(duì)酯化力的影響

在37℃、72 h培養(yǎng)時(shí)間條件下，研究接種量的影響，分別以1%、2%、3%、4%4個(gè)接種量下測(cè)定酯化力的大小，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎測(cè)酯化力。每個(gè)接種量做3個(gè)平行，重復(fù)3組實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.3 培養(yǎng)溫度對(duì)酯化力的影響

在3%接種量、72 h培養(yǎng)條件下，研究培養(yǎng)溫度的影響，在37℃、42℃、47℃、52℃ 4個(gè)培養(yǎng)溫度下測(cè)定酯化力的大小，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎測(cè)酯化力，測(cè)定方法見(jiàn)1.2.1。每個(gè)溫度做3個(gè)平行，重復(fù)3組實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.4 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可通過(guò)少量的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)來(lái)獲得整個(gè)實(shí)驗(yàn)域內(nèi)豐富的實(shí)驗(yàn)信息，從而得出全面的結(jié)論，因此具有設(shè)計(jì)靈活、不需要獲得導(dǎo)數(shù)信息、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、可靠性高、可多方向同時(shí)尋優(yōu)等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為3因素4水平正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZP-28的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)判斷是否為陽(yáng)性擴(kuò)增。樣品和Marker的上樣量為4 μL。設(shè)定電壓為150 V，電泳時(shí)間15 min。接通電極，PCR產(chǎn)物由陰極向陽(yáng)極移動(dòng)。電泳結(jié)束后紫外成像觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 正交實(shí)驗(yàn)表

圖1 PCR擴(kuò)增跑膠結(jié)果

將測(cè)序所得到的16S rDNA全序列利用CExpress完成拼接，提交到Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，并應(yīng)用Blast軟件進(jìn)行同源性搜索，序列結(jié)果用NCBI在線工具Blast在Gene Bank內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對(duì)，并用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，確定ZP-28是枯草芽孢桿菌。

2.2 ZP-28的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

ZP-28的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3，左垂直軸是OD值，右垂直軸是活菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值。由圖3可知，將菌株接種到LB液體培養(yǎng)基后，在0～6 h期間，OD值和活菌總數(shù)增加較慢，表明該菌株的生長(zhǎng)很緩慢，此段時(shí)期內(nèi)該菌株處于延遲期；在6～24 h期間，OD值和活菌總數(shù)增加較快，表明該菌株生長(zhǎng)速率最大，屬于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該時(shí)期內(nèi)菌體數(shù)量在大量迅速的增加，當(dāng)生長(zhǎng)到15 h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期，取此時(shí)期的微生物作為種子液可以保證菌種的活性達(dá)到快速增殖的效果；培養(yǎng)24 h后，OD值和活菌總數(shù)增加較慢，表明該菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，也是積累代謝產(chǎn)物的一個(gè)階段，該期OD值有不顯著的上升，這可能是因?yàn)榫w細(xì)胞死亡后仍在培養(yǎng)液中，這會(huì)影響到吸光度的測(cè)定，從而使OD值仍有緩慢的上升跡象；30 h后，OD值和活菌總數(shù)有下降趨勢(shì)，這表明由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累抑制了微生物的生長(zhǎng)繁殖，菌體量開始緩慢下降，OD值也隨著有所降低。

2.3 麩皮培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 生長(zhǎng)曲線

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酯化力的影響

在37℃，3%接種量條件下，研究不同培養(yǎng)時(shí)間下酯化力高低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酯化力呈先增加后降低的趨勢(shì)。培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，酯化力較低，其發(fā)酵不完全。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，麩曲的酯化力最高，與48 h的發(fā)酵產(chǎn)物酯化力相比有了較高的提高。繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，酯化力不增反而呈降低趨勢(shì)。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間的酯化力

2.3.2 接種量對(duì)酯化力的影響結(jié)果

在37℃，72 h培養(yǎng)時(shí)間條件下，研究不同接種量對(duì)酯化力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著接種量的增加，酯化力先增高后降低。接種量為1%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的酯化力較低。當(dāng)接種量為2%時(shí)，麩曲的酯化力最高，與1%接種量的發(fā)酵產(chǎn)物相比有了明顯的提高。之后增大菌種的接種量，發(fā)酵產(chǎn)物的酯化力沒(méi)有明顯的提高。

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)酯化力的影響

在3%接種量、72 h培養(yǎng)條件下，研究不同培養(yǎng)溫度對(duì)酯化力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著培養(yǎng)溫度的提高，酯化力先增高后降低。培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的酯化力隨著培養(yǎng)溫度的增加不斷提高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為47℃時(shí)，麩曲的酯化力最高，隨后再提高培養(yǎng)溫度麩曲的酯化力呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)。

圖5 不同接種量的酯化力

圖6 不同培養(yǎng)溫度的酯化力

2.3.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，選取的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間60 h，接種量2%，培養(yǎng)溫度47℃。為了更好地研究三因素之間的相互作用，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)研究。如表3所示，正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明：RC＞RA＞RB，所以各因素的主次順序?yàn)镃＞A＞B，即接種量對(duì)酯化力影響最大，其次是培養(yǎng)溫度，對(duì)酯化力影響最小的是培養(yǎng)時(shí)間。選擇K值最大所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)條件，即接種量為2%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h，在該培養(yǎng)條件下預(yù)計(jì)酯化力較高。

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)條件，即接種量為2%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h。根據(jù)該條件將2%種子液接種到麩皮培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，每隔幾小時(shí)搖勻1次，培養(yǎng)結(jié)束后取出烘干粉碎，測(cè)酯化力，結(jié)果為33.6 U±0.021 U，比其他培養(yǎng)條件下酯化力都要高，進(jìn)一步驗(yàn)證了正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

將1株從郎酒酒糟中篩選得到的耐酸產(chǎn)酯香細(xì)菌ZP-28采用分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)該菌株的16S rDNA序列分析結(jié)果顯示，該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。測(cè)定了ZP-28菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，在6～24 h期間，該菌株生長(zhǎng)速率最大，屬于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該時(shí)期內(nèi)，一方面菌體數(shù)量在大量迅速的增加，培養(yǎng)24 h后該菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，在菌株培養(yǎng)末期OD值有不顯著的上升。因?yàn)榫晟L(zhǎng)到15 h時(shí)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期，取此時(shí)期的微生物作為種子液可以保證菌種的活性達(dá)到快速增殖的效果，最終確定菌液培養(yǎng)時(shí)間為15 h。以該菌株為出發(fā)菌株，分別從溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間3方面設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)研究發(fā)酵條件，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)ZP-28發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。正交結(jié)果顯示，接種量對(duì)酯化力影響最大，其次是培養(yǎng)溫度，對(duì)酯化力影響最小的是培養(yǎng)時(shí)間。最終確定在培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h，接種量為2%的條件下得到的麩曲的酯化力較高，為33.6 U±0.021 U。深入生產(chǎn)實(shí)踐，還需要進(jìn)一步進(jìn)行工廠發(fā)酵實(shí)驗(yàn)探討研究。