神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasm,NEN)是一組起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和肽能神經(jīng)元的較為少見的疾病，可呈現(xiàn)出從無癥狀惰性生長、低度惡性到高度惡性高轉(zhuǎn)移性的一系列腫瘤，其中發(fā)生于胃腸胰(gastroenterologgy-pancrology,GEP)的NEN最常見，占所有NEN的55%～70%。NEN的確診主要依賴病理學(xué)檢查。嗜鉻粒蛋白A(CgA)、突觸素(Syn)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)均為經(jīng)典的NEN標(biāo)志物，其中CgA特異性最高，但敏感度不高[1]。促泌素(secretagogin，SCGN)是2000年由Wagner等[2]發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，在NEN高表達(dá)。本研究檢測(cè)GEP -NEN中SCGN和CgA的表達(dá)，探討其診斷價(jià)值。

一、對(duì)象與方法

1．研究對(duì)象：收集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2011年1月至2016年4月間收治的GEP-NEN患者36例，其中男性26例，女性10例，年齡18～81歲，平均(53±14)歲。腫瘤位于胃10例，腸道10例(其中直腸9例，小腸1例)，胰腺16例。根據(jù)2013年中國胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理診斷共識(shí)[3]的腫瘤病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，G1級(jí)14例，G2級(jí)10例，G3級(jí)12例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2．方法：所有腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)染色PV-6000法檢測(cè)SCGN、CaA蛋白表達(dá)，試劑盒購自英國ABCAM公司，嚴(yán)格按照說明書操作?？筍CGN一抗稀釋濃度為1∶5 000?？笴gA一抗稀釋濃度為1∶500，最后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。以已知陽性切片為陽性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。所有切片均由兩位資深病理科醫(yī)師分別雙盲法閱片，選擇10個(gè)具有代表性的高倍鏡視野(×400)，以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，依據(jù)陽性細(xì)胞百分比及細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，取平均值。若兩人評(píng)分相差3分則重新評(píng)定。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：0分，無陽性細(xì)胞；1分，陽性細(xì)胞占1%～10%；2分，陽性細(xì)胞占11%～50%；3分，陽性細(xì)胞占51%～80%；4分，陽性細(xì)胞占81%～100%。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：陰性，0分；弱陽性，1分；中度陽性，2分；強(qiáng)陽性，3分。兩分值相乘，0分為陰性；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為陽性(++)；9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)有序變量資料采用秩和檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多個(gè)獨(dú)立樣本間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，α=0.05；多個(gè)獨(dú)立樣本間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)并進(jìn)行調(diào)整，α′=α/3，即α′=0.017。

二、結(jié)果

1．SCGN、CgA的陽性表達(dá)：36例GEP-NEN的SCGN陽性表達(dá)率為88.9%(32/36)，CgA陽性表達(dá)率為66.7%(24/36，圖1)，SCGN陽性率顯著高于CgA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.143，P=0.045)。

圖1 直腸NEN的SCGN表達(dá)(1A)及胰腺NEN的CgA表達(dá)(1B，免疫組化染色 ×400)

2．不同部位NEN的SCGN、CgA陽性表達(dá)：胃、腸道、胰腺不同部位NEN的SCGN表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CgA在不同部位的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=0.249，P=0.000，表1)。其中CgA在腸NEN中的表達(dá)率顯著低于在胃或胰腺NEN中的表達(dá)率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z值分別為-3.749、-4.214，P值均<0.017)，在胃與胰腺NEN中的表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SCGN與CgA在GEP-NEN中的表達(dá)

3．不同病理分級(jí)NEN的SCGN、CgA陽性表達(dá)： G1、G2、G3級(jí)NEN中SCGN陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=8.472，P=0.018，表2)，其中G1與G2級(jí)、G2與G3級(jí)NEN的SCGN陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而G3級(jí)NEN的SCGN表達(dá)率顯著低于G1級(jí)(秩均值：13.67比24.18)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.506，P<0.017)。不同病理分級(jí)NEN的CgA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4．SCGN、CgA表達(dá)與NEN臨床病理參數(shù)的相關(guān)性：NEN的SCGN表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤神經(jīng)侵犯或脈管癌栓無相關(guān)性(P>0.05)，而與腫瘤長徑≥2 cm、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)(P值均<0.05)。CgA表達(dá)與NEN所有臨床病理參數(shù)均無相關(guān)性(表3)。

表2 不同病理分級(jí)NEN的SCGN及CgA表達(dá)

表3 SCGN、CgA表達(dá)與NEN臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討論神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NEN)是一種具有高度異質(zhì)性且少見的腫瘤，大部分起源于散在的肽能神經(jīng)元或神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，這類細(xì)胞具有胺前體攝取功能和脫羧功能，能夠分泌肽類激素或生物活性胺。由于疾病早期多缺乏典型的臨床癥狀，加之大部分臨床醫(yī)師對(duì)該病不甚了解，較容易發(fā)生漏診或誤診。有研究顯示，從腫瘤發(fā)生到確診平均需要5～7年，且多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)通常已發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，胰腺NEN患者在確診時(shí)60%已發(fā)生轉(zhuǎn)移[4-5]。不同病理分級(jí)NEN患者之間或者無轉(zhuǎn)移與有轉(zhuǎn)移患者之間的預(yù)后均有明顯差異[6-7]。由此可見，早期診斷NEN可使患者大獲裨益,因此有必要尋找更敏感的NEN標(biāo)志物用于臨床診斷。

GEP-NEN的確診主要依靠病理學(xué)檢查SCGN，CgA作為目前公認(rèn)的傳統(tǒng)NEN標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于臨床NEN的病理診斷，還可用于檢測(cè)NEN的治療效果和判斷預(yù)后。SCGN具有6個(gè)平行的EF手型鈣離子結(jié)合域，具有鈣離子結(jié)合能力。目前對(duì)其研究多集中于阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病或者腦卒中等應(yīng)激性神經(jīng)損傷，而在NEN方面研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，SCGN位于神經(jīng)元或神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，偶可在胞核中檢測(cè)到[8]。在典型或非典型的NEN或伴有神經(jīng)內(nèi)分泌分化的組織中可見SCGN表達(dá)，而在消化道各種類型的腺癌或增生性息肉、炎性息肉中未見表達(dá)。在一些內(nèi)分泌器官的腫瘤如嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腺瘤等腫瘤組織中也可見SCGN表達(dá)。CgA陰性的NEN中SCGN陽性表達(dá)，提示其可能具有更高的敏感性[9]。本研究結(jié)果顯示，36例GEP-NEN的SCGN陽性率為88.9%，高于CgA的66.7%，提示SCGN診斷NEN的敏感性更好。

另有研究顯示，CgA在NEN細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)不一致，在某些器官或組織，例如肺、直腸、闌尾等不表達(dá)[10]，因此在2013年的美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南中將其列為診斷NEN的3類證據(jù)[11]。而SCGN在直腸、闌尾等部位的NEN中表達(dá)，在肺NEN中也呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率幾乎達(dá)到100%。本研究結(jié)果顯示，在胃和胰腺NEN，SCGN和CgA均高表達(dá)，但在腸道NEN中9例SCGN陽性，而CgA均呈陰性表達(dá)，提示SCGN聯(lián)合CgA診斷GEP-NEN可更好地提高檢出率。

2010年WHO腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)將消化系統(tǒng)NEN分為G1、G2、G3 3個(gè)等級(jí)。既往研究提示CgA在高分化NET中多呈彌散性強(qiáng)陽性表達(dá)，在低分化NEC中則弱表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示，CgA在G1、G2、G3級(jí)NEN中均高表達(dá)，且表達(dá)水平在不同級(jí)別中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與樣本量相對(duì)較少有關(guān)。但SCGN在G3級(jí)NEN中表達(dá)顯著低于G1級(jí)NEN，提示SCGN可輔助判斷NEN分級(jí)，并有望成為GEP-NEN的早期診斷標(biāo)志物。研究表明，在典型的伴有淋巴轉(zhuǎn)移的NEN患者血漿中可檢測(cè)到SCGN[13]。本研究結(jié)果表明，SCGN的表達(dá)水平在腫瘤長徑≥2 cm、伴淋巴轉(zhuǎn)移的NEN組織中低表達(dá)，推斷其可能與GEP-NEN的轉(zhuǎn)移有關(guān)。