胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms, P-NENs)以前稱為胰腺內(nèi)分泌腫瘤、胰島細(xì)胞瘤或APUD瘤等[1]，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)在2010年第4版的消化系統(tǒng)腫瘤分類中將其統(tǒng)稱為P-NENs[2]。P-NENs比較少見(jiàn)，僅占胰腺腫瘤的2%～7%[3-4]，但近年來(lái)發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)[5-6]。按照2010年WHO消化系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分類和命名[2]以及2014年中國(guó)P-NENs診治專家共識(shí)[5]，P-NENs分為神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(neuroendocrine tumor, NET)、神經(jīng)內(nèi)分泌癌(neuroendocrine carcinoma, NEC)和混合性腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌(mixed adenoneuroendocrine carcinoma, MANEC)。根據(jù)組織學(xué)核分裂象和增殖活性分為G1、G2、G3級(jí)。中國(guó)胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理診斷共識(shí)(2013版)建議將少數(shù)形態(tài)學(xué)分化良好、其中含有增殖活性高于G1/G2的腫瘤(核分裂象>20個(gè)/10個(gè)高倍視野，Ki67>20%)命名為“高增殖活性的NET”[7]。P-NENs的分級(jí)、分期與臨床治療方案選擇及預(yù)后評(píng)估密切相關(guān)，隨著靶向治療的進(jìn)展，精準(zhǔn)的病理診斷對(duì)臨床治療的指導(dǎo)意義尤為重要。本研究回顧性分析P-NENs患者的臨床病理資料及免疫表型，以探討P-NENs的臨床病理特征及影響預(yù)后的相關(guān)因素。

資料與方法

一、一般資料

收集2011年12月至2017年9月間中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院手術(shù)及經(jīng)病理確診的72例P-NENs患者的臨床資料，記錄患者的性別、年齡、病理組織學(xué)檢查結(jié)果、瘤體大小(長(zhǎng)寬高三徑線相乘)、局部浸潤(rùn)(十二指腸、膽管及脾)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。

二、方法

1．P-NENs病理分級(jí)：取石蠟包埋標(biāo)本，切片后行蘇木精-伊紅(HE)染色，由兩名資深病理醫(yī)師高倍鏡下(×400)選擇50個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)活躍區(qū)視野，計(jì)數(shù)核分裂象，取均值，折算為10個(gè)高倍鏡視野(10HPF，2 mm2)的核分裂象數(shù)。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞Ki67表達(dá)，Ki67抗體購(gòu)自DAKO公司，工作濃度為1∶3，以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。在核陽(yáng)性最強(qiáng)的區(qū)域計(jì)數(shù)500～2 000個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比作為Ki67增殖指數(shù)。

按照中國(guó)2013胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2]，根據(jù)核分裂象計(jì)數(shù)和Ki67增殖指數(shù)將P-NENs分為NET G1級(jí)(核分裂數(shù) ≤1個(gè)/10HPF，Ki67≤2%)、NET G2級(jí)(核分裂數(shù)2～20個(gè)/10HPF，Ki67為3%～20%)、NET G3級(jí)(核分裂數(shù)>20個(gè)/10HPF，Ki67>20%)、NEC G3級(jí)(核分裂數(shù)>20個(gè)/10HPF，Ki67>20%)。

2．P-NENs免疫表型：采用免疫組織化學(xué)染色EnVision兩步法檢測(cè)突觸素(synaptophysin,Syn)、嗜鉻粒素A(chromogranin A, CgA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(CD56)的表達(dá)。Syn抗體購(gòu)自福州邁新公司，工作濃度為1∶100；CgA、NSE抗體均購(gòu)自北京中杉金橋公司，工作濃度分別為1∶600和1∶200；CD56抗體購(gòu)自廣州泉輝公司，工作濃度為1∶200。以胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，鏡下觀察細(xì)胞著色強(qiáng)度，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，無(wú)著色或陽(yáng)性細(xì)胞<5%為陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞≥5%為陽(yáng)性表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、P-NENs的臨床病理特征

72例P-NENs中男性24例(33.3%)，女性48例(66.7%)，發(fā)病年齡為12～76歲，中位年齡為56歲。NET G1級(jí) 24例(33.3%)、NET G2級(jí) 44例(61.1%)、NEC G3 4例(5.6%)，其中有1例腫瘤組織Ki67 25%，符合高增殖活性的NET標(biāo)準(zhǔn)，但腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)良好故歸入G2級(jí)。P-NENs分級(jí)與瘤體大小、十二指腸和脾局部侵犯、神經(jīng)束浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈顯著相關(guān)(P值均<0.05，表1)。

此外，G2與G3級(jí)內(nèi)腫瘤分級(jí)相同的病例比較，瘤體越大，局部侵犯的發(fā)生率也越高(P<0.001)；G1與G2級(jí)間神經(jīng)束浸潤(rùn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.005，P=0.94)，但G3級(jí)神經(jīng)束浸潤(rùn)發(fā)生率顯著高于G1和G2級(jí)(χ2=6.18，P<0.001)。

表1 72例P-NENs患者的臨床病理特征比較

注：a：方差分析

二、P-NENs的病理學(xué)形態(tài)特征

HE染色結(jié)果顯示，低級(jí)別 (G1、G2) P-NENs細(xì)胞呈巢團(tuán)狀、緞帶狀、梁索狀、腺樣、假菊形團(tuán)狀等排列，瘤細(xì)胞形態(tài)相對(duì)一致，核染色質(zhì)呈胡椒鹽樣，核分裂象少見(jiàn)。 高級(jí)別(NEC G3)腫瘤包括小細(xì)胞癌和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌，細(xì)胞明顯多形性，呈較大實(shí)性片狀排列，核質(zhì)比明顯增高，核深染，壞死常見(jiàn)(圖1 )。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Syn陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)彌散分布的棕色顆粒，陽(yáng)性率為98.6%(71/72)；CgA陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)彌散分布的棕色顆?；虺示衷钚园|(zhì)內(nèi)陽(yáng)性顆粒，陽(yáng)性率為95.8%(69/72)；NSE陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)彌散分布的棕色顆粒，陽(yáng)性率為88.9%(64/72)；CD56陽(yáng)性細(xì)胞胞膜呈棕黃色著色，陽(yáng)性率為90.3%(65/72)。不同分級(jí)腫瘤之間表型標(biāo)志物陽(yáng)性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1，表2)。

圖1 P-NENs的組織學(xué)特征。NET G1級(jí)細(xì)胞呈梁索狀、腺樣排列(1A，HE ×100)；NET G2 級(jí)細(xì)胞呈巢團(tuán)狀排列(1B，HE ×200)；NEC G3級(jí)細(xì)胞異型性明顯伴壞死(1C，HE ×100)；腫瘤細(xì)胞CgA(1D)、Syn(1E)及Ki-67表達(dá)(1F，免疫組化 ×100)

表2 72例P-NENs患者的免疫表型標(biāo)志物表達(dá)的比較

討 論

P-NENs是一組明顯異質(zhì)性的腫瘤，可以表現(xiàn)為惰性的緩慢生長(zhǎng)、低度惡性、高轉(zhuǎn)移性等不同的生物學(xué)特征。WHO報(bào)道的NEC G3級(jí)占比為2%～3%[2]，本組NEC占5.6%，比例稍高。

與胃腸道其他部位NET男性發(fā)病多于女性不同，本組女性患者是男性患者的2倍，與有的臨床研究結(jié)果相符[8-9]?；颊甙l(fā)病年齡跨度較大，但仍以中老年為主，中位年齡56歲，然而性別、年齡與腫瘤分級(jí)之間無(wú)明確相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，腫瘤體積越大，腫瘤分級(jí)越高，與要文青等[10]報(bào)道相符。P-NENs局部侵犯總發(fā)生率為12.5%，且均發(fā)生在G2與G3級(jí)，而G3級(jí)的發(fā)生率又明顯高于G2級(jí)，提示局部侵犯是P-NENs惡性生物學(xué)特征之一。而G2與G3級(jí)內(nèi)腫瘤分級(jí)相同的病例比較，發(fā)生局部侵犯的腫瘤體積也顯著大于無(wú)局部侵犯的腫瘤體積，表明瘤體大小也是影響腫瘤局部侵犯的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，P-NENs神經(jīng)束浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處肝轉(zhuǎn)移與腫瘤分級(jí)也相關(guān)。

有研究報(bào)道，以5%作為Ki67增殖指數(shù)的臨界值對(duì)胰腺NET的預(yù)后提示更有意義。本組以Ki67>5%為閾值將G1、G2 NET重新分組，再按照同樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各級(jí)NET的預(yù)后指標(biāo)，包括瘤體大小、局部侵犯、神經(jīng)束浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)G1、G2組間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)報(bào)道的情況有所不同[11]，原因值得進(jìn)一步探討。

Syn、CgA以及Ki67被公認(rèn)為是NET診斷必要的檢測(cè)項(xiàng)目[2,12-13]。Syn是一種位于突觸前囊泡內(nèi)的糖蛋白，絕大多數(shù)的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞可彌散表達(dá)Syn。CgA為嗜鉻顆粒，存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)元的分泌囊泡內(nèi)，但此類囊泡并不是所有的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞均含有。本研究Syn的陽(yáng)性率為98.6%，CgA的陽(yáng)性率為95.8%，Syn陽(yáng)性率略高于CgA，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[9,14]，但也有文獻(xiàn)報(bào)道P-NENs的CgA陽(yáng)性率較Syn要高一些[15-16]，不過(guò)差異較小。大部分患者CgA與 Syn 同時(shí)陽(yáng)性，少數(shù)為其中一項(xiàng)陽(yáng)性，但并未見(jiàn)CgA與Syn都是陰性的，所以，臨床診斷要綜合兩種標(biāo)志物進(jìn)行判斷，至少要有一種陽(yáng)性，否則不能診斷為NET。增殖指數(shù)Ki67可反映細(xì)胞的增殖活性，指數(shù)高提示細(xì)胞增殖活躍，它是影響胃腸胰NET預(yù)后的獨(dú)立因素[13]。NET診斷中還有一些可選標(biāo)志物，如NSE和CD56。本組病例NSE陽(yáng)性率為88.9%，CD56陽(yáng)性率為90.3%。NSE因其敏感性高但特異性差，而限制了它的應(yīng)用。但其優(yōu)勢(shì)在于患者血清中NSE的濃度與腫瘤的大小及惡性轉(zhuǎn)移程度相關(guān)，對(duì)化療有明顯反應(yīng)的患者血清NSE水平明顯下降。CD56敏感性較高，其表達(dá)與腫瘤的高侵襲性有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，腫瘤表型標(biāo)志物Syn、CgA、NSE及CD56的陽(yáng)性率在腫瘤分級(jí)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能作為判斷病情及預(yù)后的獨(dú)立因素。