應(yīng)朝霞 肖生祥 王永賢 周俊 任建文 黃鶯 宋劉梅 樊文昕 劉艷

[摘要]目的：研究CYLD蛋白在毛發(fā)上皮瘤、毛母細(xì)胞瘤和汗管瘤等皮膚附屬器腫瘤中的分布、表達(dá)特征，探索皮膚附屬器腫瘤的發(fā)病機(jī)理。方法：收集毛發(fā)上皮瘤、毛母細(xì)胞瘤和汗管瘤患者皮損，進(jìn)行CYLD蛋白免疫組織化學(xué)染色，并通過IPP軟件測(cè)定平均光密度值進(jìn)行半定量分析。結(jié)果：毛發(fā)上皮瘤組、毛母細(xì)胞瘤組的平均光密度值均低于正常人毛囊對(duì)照組（P<0.001），但毛發(fā)上皮瘤組和毛母細(xì)胞瘤組CYLD蛋白平均光密度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。汗管瘤組的平均光密度值低于正常人汗腺對(duì)照組（P<0.001）。結(jié)論：CYLD蛋白表達(dá)于正常角質(zhì)形成細(xì)胞（基底層和顆粒層為主）、毛囊、汗腺和皮脂腺的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周圍區(qū)域；毛發(fā)上皮瘤、毛母細(xì)胞瘤、汗管瘤的腫瘤組織中CYLD蛋白表達(dá)水平均顯著下降，提示這三種皮膚附屬器腫瘤的致病機(jī)理可能與CYLD蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]CYLD蛋白；毛發(fā)上皮瘤；毛母細(xì)胞瘤；汗管瘤；光密度值

[中圖分類號(hào)]R739.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）09-0114-04

Comparison on Expression of CYLD Protein in Trichoepithelioma，

Trichoblastoma， Syringoma

YING Zhao-xia，XIAO Sheng-xiang，WANG Yong-xian，ZHOU Jun，REN Jian-wen，HUANG Ying，SONG Liu-mei，F(xiàn)AN Wen-xin，LIU Yan

（Department of Dermatology，the Second Hospital，Xian Jiaotong University，Xian 710004，Shaanxi，China）

Abstract： Objective To further define the distribution and expression characteristics of the CYLD protein in normal skin and adnexal tumor of skin，to explore the pathogenesis of adnexal tumors of skin. Methods The expression of CYLD protein in trichoepithelioma， trichoblastoma， syringoma and normal skin was detected by immunohistochemistry. IPP softwares were applied to measure mean optical density value for semiquantitative analysis. Results The mean optical density value of CYLD protein in the trichoepithelioma group and the trichoblastoma group was lower than those of the normal hair follicle group， the differences were statistically significant（P<0.001）. However， there was no significant difference in the mean optical density value of CYLD protein between the trichoepithelioma group and the trichoblastoma group（P>0.05）. The mean optical density value of CYLD protein in the syringoma group was lower than that in the normal sweat glands group（P<0.001）. Conclusion This study suggested that CYLD protein was expressed in cytoplasm and the surrounding area of nuclei of normal keratinocyte （mainly in base layer and granular layer）， hair follicles， sweat glands and sebaceous glands. To compared with normal hair follicles and sweat glands， in the tumor tissue， as trichoepithelioma、trichoablastoma and syringoma， CYLD protein expressions were significantly decreased， suggesting that the pathogenesis of the three skin adnexal tumors may be related to the down regulation of CYLD protein expression.

Key words： CYLD protein； trichoepithelioma； trichoblastoma； syringoma； optical density value

腫瘤抑制因子頭帕腫瘤綜合征蛋白（Cylindromatosis，CYLD）是一種去泛素化酶，突變后會(huì)引起CYLD蛋白功能缺失，進(jìn)而影響頂泌汗腺和外分泌腺干細(xì)胞的正常分化，可能會(huì)導(dǎo)致皮膚附屬器細(xì)胞生長(zhǎng)失衡而誘發(fā)各種腫瘤發(fā)生[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，去泛素化酶CYLD突變可導(dǎo)致多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤（Multiple familial trichoepithelioma，MFT）、家族性圓柱瘤（Familial cylindroma，F(xiàn)C）及Brooke-Spiegler綜合征（BSS），呈常染色體顯性遺傳，但臨床及病理表現(xiàn)不同，這些腫瘤可能是同一單基因病的表型變異[2]。CYLD基因型與臨床表型之間的關(guān)系、CYLD蛋白功能缺陷引起的病理改變及CYLD突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機(jī)制仍需更深入的研究。毛發(fā)上皮瘤和毛母細(xì)胞瘤均屬于較少見的毛源性良性皮膚附屬器腫瘤，而汗管瘤為發(fā)病率較高的表皮內(nèi)小汗腺導(dǎo)管的一種腺瘤，發(fā)病原因均不明確，臨床缺少可靠治療手段。因此，為了解CYLD蛋白在毛囊和汗腺為主的皮膚附屬器腫瘤中的發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)中分析了毛發(fā)上皮瘤、毛母細(xì)胞瘤和汗管瘤這三種皮膚附屬器腫瘤中CYLD蛋白的表達(dá)特征，試圖探索CYLD蛋白對(duì)皮膚附屬器腫瘤的影響和作用，揭示皮膚附屬器腫瘤的致病機(jī)理。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象：本研究中病例均來源于筆者醫(yī)院門診，采用的病變組織均經(jīng)臨床和常規(guī)HE組織病理檢查明確診斷的腫瘤病變組織，包括毛發(fā)上皮瘤（含非家族散發(fā)型及多發(fā)性家族型兩種類型）（Trichoepithelioma，TE）10例、毛母細(xì)胞瘤（Trichoablastoma，TB）5例、汗管瘤（Syringoma）10例，10%福爾馬林固定，常規(guī)制成蠟塊，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢查。取正常人皮膚（含正常汗腺組織和毛囊）作為陽性對(duì)照，以PBS代替CYLD抗體作為陰性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：YGQ-2158型病理切片機(jī)、切片漂烘溫控儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱（亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；顯微鏡（日本，Olympus）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑：①一抗：兔抗人CYLD抗體原液100μl（美國(guó)GeneTex 公司）；②SP法免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），包括：二抗（兔抗人lgG，為親和純化抗體，可標(biāo)記長(zhǎng)臂生物素）；SP（Streptavidin-perosidase，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶）；1.5% BSA（牛血清白蛋白）封閉液；③濃縮型DAB（二氨基聯(lián)苯胺，3，3-diaminobenzidine）顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；④PBS緩沖液（磷酸緩沖液，Phosphate Buffer solution ）；⑤10% 水合氯醛；⑥8% 硫化鈉。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 免疫組化染色：將包埋好的組織蠟塊冰凍切成約4μm厚薄片，置于APES載玻片上，隨后放入烤箱1h使切片緊密粘附；切片常規(guī)脫蠟、晾干；熱平臺(tái)10min修復(fù)抗原；0.3% H2O2室溫內(nèi)放置30min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗；滴加5% BSA封閉液，放置于室溫內(nèi)約20min；滴加適量一抗，37℃孵育90min；PBS沖洗3次，約3min；滴加適量生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min；PBS沖洗3次，約3min；滴加適量SP，37℃孵育30min；PBS沖洗3次，約3min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。其中以PBS緩釋液代替一抗作陰性對(duì)照。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果并采用Image-Pro Plus（IPP）圖像分析軟件采集數(shù)據(jù)。

1.4.2 Image-Pro Plus（IPP）圖像分析軟件系統(tǒng)：對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，選擇測(cè)量參數(shù)為：Area、Density（Mean）、IOD。每張切片在400倍的固定視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量平均光密度值，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.3 免疫組化染色質(zhì)量控制：設(shè)置陰性和陽性對(duì)照，所有抗體在實(shí)驗(yàn)前配制，抗體孵育及DAB顯色的溫度及時(shí)間均固定，結(jié)果判定采用單盲法，取正常人皮膚（含正常汗腺組織和毛囊）作為陽性對(duì)照，以PBS代替CYLD抗體作為陰性對(duì)照。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用配對(duì)設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)和方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果：正常皮膚組織中，CYLD蛋白在表皮細(xì)胞（尤其是基底層和顆粒層細(xì)胞）、毛囊、皮脂腺和汗腺的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周圍區(qū)域可見黃色或棕黃色顆粒沉積，均呈陽性表達(dá)；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景清晰。其次，以PBS代替CYLD抗體制作的陰性對(duì)照未見任何非特異性著色。毛發(fā)上皮瘤和毛母細(xì)胞瘤組織中CYLD蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度降低；汗管瘤組織中CYLD蛋白表達(dá)水平亦出現(xiàn)下降。見圖1。

2.2 半定量分析結(jié)果

2.2.1 毛發(fā)上皮瘤組（TE組）、毛母細(xì)胞瘤組（TB組）和正常人毛囊對(duì)照組（NHF組）兩兩比較結(jié)果：TE組CYLD蛋白平均光密度值為（0.214±0.015），TB組為（0.199±0.015），NHF組為（0.335±0.024），經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，TE組、TB組CYLD蛋白平均光密度值低于NHF組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-13.515，P<0.001；t=-11.403，P<0.001）；TE組和TB組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.758，P=0.102）。見圖2。

2.2.2 汗管瘤（Syringoma）組和正常人汗腺對(duì)照組（NSG組）比較結(jié)果：Syringoma組CYLD蛋白平均光密度值為0.228±0.007低于NSG組的0.372±0.017，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-24.304，P<0.001）。見圖3。

3 討論

CYLD基因是一種重要的腫瘤抑制因子，又稱圓柱瘤基因，相關(guān)報(bào)道提示CYLD基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能密切相關(guān)[2]。皮膚附屬器腫瘤是一類較罕見但相關(guān)的腫瘤組織，這類腫瘤的特點(diǎn)是向表皮附屬器分化，而不會(huì)向表皮分化，包括毛囊、皮脂腺、頂泌汗腺和小汗腺。某個(gè)體也可表現(xiàn)出多種類型分化的腫瘤，因此，皮膚附屬器腫瘤具有向多種腫瘤發(fā)展的趨勢(shì)和出現(xiàn)家族綜合征的共同特征[3]。毛發(fā)上皮瘤（Trichoepithelioma，TE）具有多發(fā)性家族型及非家族散發(fā)型。多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤（Multiple familial trichoepithelioma， MFT）呈常染色體顯性遺傳，該病罕見，但少數(shù)會(huì)惡變?yōu)榛准?xì)胞癌（Basal cell carcinoma，BCC）或毛母細(xì)胞癌；而非家族散發(fā)型毛發(fā)上皮瘤多與遺傳因素?zé)o關(guān)，有時(shí)與圓柱瘤、粟丘疹或汗腺瘤同時(shí)存在[4]。張學(xué)軍等[5]將MFT致病基因定位于16q12-16q13的CYLD基因，近年來，陸續(xù)有MFT家系中出現(xiàn)CYLD基因突變的報(bào)道，研究小組新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)中國(guó)MFT家系中患者位于CYLD基因10號(hào)外顯子c.1178-1179- delCA（p.T393fs）移碼突變，在395位提前出現(xiàn)終止密碼[6]。毛母細(xì)胞瘤（Trichoblastoma，TB）是一種較少見的毛源性、向?yàn)V泡細(xì)胞分化的良性皮膚附屬器腫瘤[7]；而汗管瘤（Syringoma）為發(fā)病率較高的向外分泌腺分化的一種良性腺瘤，組織化學(xué)研究證明汗管瘤含典型小汗腺起源的磷酸化酶和水解酶，部分患者有家族史[8]。這三種皮膚良性腫瘤都好發(fā)于面部，且隨年齡逐漸增多增厚，出現(xiàn)部分融合，個(gè)別病例發(fā)展為惡變，對(duì)患者身心均可造成不良后果。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果首先顯示CYLD蛋白表達(dá)于正常角質(zhì)形成細(xì)胞，增生活躍的基底層和顆粒層細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)；皮膚附屬器（毛囊、汗腺和皮脂腺）組織細(xì)胞中均可見CYLD蛋白陽性表達(dá)。初步證明具有去泛素化酶活性的CYLD蛋白在皮膚組織細(xì)胞中普遍存在，并在表皮細(xì)胞增殖分化中起著一定的作用。也說明表皮中角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，是通過控制細(xì)胞增生和細(xì)胞凋亡的平衡來實(shí)現(xiàn)的[9]。

本次還觀察到，相比于正常毛囊和汗腺，毛發(fā)上皮瘤、毛母細(xì)胞瘤、汗管瘤患者的腫瘤組織中CYLD蛋白表達(dá)水平均顯著下降，其中，不僅具有遺傳異質(zhì)性的MFT中CYLD蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，目前被認(rèn)為與遺傳因素?zé)o關(guān)的散發(fā)型毛發(fā)上皮瘤、毛母細(xì)胞瘤和汗管瘤中CYLD蛋白表達(dá)亦明顯下調(diào)，提示與汗腺和毛囊有關(guān)的這三種皮膚附屬器腫瘤的致病機(jī)理均與CYLD蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。這與已報(bào)道的研究預(yù)測(cè)一致，皮膚附屬器腫瘤的發(fā)生可能均由CYLD基因突變所致[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅顯示去泛素化酶活性的CYLD蛋白在正常皮膚、皮膚附屬器（毛囊、汗腺和皮脂腺）組織細(xì)胞中分布廣泛并普遍存在；而且還提示CYLD蛋白的表達(dá)下調(diào)可能與毛發(fā)上皮瘤、毛母細(xì)胞瘤、汗管瘤這三種皮膚附屬器腫瘤的致病機(jī)理有關(guān)。表明CYLD蛋白在維持正常皮膚和皮膚附屬器組織的正常生理功能、抑制皮膚附屬器腫瘤的發(fā)生起著非常重要的作用。

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[收稿日期]2018-07-12 [修回日期]2018-08-22

編輯/朱婉蓉