耿樹香，楊生超，寧德魯，李勇杰

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201；2.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南 昆明 650201)

油橄欖(OleaeuropaeaL.)是世界著名的優(yōu)質(zhì)木本油料樹種，主要為異花授粉植物，為二倍體植物(2n=46)，全基因組約為2 200Mb。在長期引種馴化和人工選擇過程中，形成了遺傳變異豐富并具有優(yōu)良性狀的油橄欖品種，對這些品種的正確鑒定和特異性狀的鑒別，了解品種間遺傳變異和多樣性，是油橄欖品種資源利用和育種工作的重要前提[1-3]。油橄欖的栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，其中包含大量的野生種、半野生種和栽培種，而且不同地域間品種交換頻繁，導(dǎo)致同名異物或同物異名的現(xiàn)象十分普遍。油橄欖品種繁多，據(jù)統(tǒng)計(jì)：世界各地油橄欖自產(chǎn)品種共計(jì)1 275個(gè)，中國現(xiàn)有登記品種共158個(gè)[4]。在油橄欖長期引種馴化及人工栽培過程中，形成了遺傳變異豐富并具有優(yōu)良性狀的油橄欖品種，對現(xiàn)云南麗江引種的油橄欖品種進(jìn)行正確鑒定及特異性狀的鑒別，勢在必行。

早先對油橄欖品種的鑒定都基于表型及農(nóng)藝性狀[5-6]。近年來，國外已有一些采用RAPD、AFLP、SSR和ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行油橄欖品種鑒定和遺傳多樣性研究的報(bào)道[7-14]。雖然利用分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確鑒定油橄欖品種并了解其遺傳信息，但難以與表型性狀相結(jié)合，缺乏分子標(biāo)記與表型性狀的驗(yàn)證分析。本研究利用已成熟的SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對收集保存麗江大具的19份油橄欖種質(zhì)(育成品種、地方種質(zhì))進(jìn)行表型性狀及遺傳分析，從DNA水平評估遺傳多樣性，并進(jìn)一步探究云南引種油橄欖種質(zhì)資源品種間的親緣關(guān)系，為今后的遺傳育種提供可靠的遺傳背景信息。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采集于云南省麗江市金沙江低山河谷地帶，24°16′N，100°04′E，海拔1 766m，砂壤。擁有獨(dú)特的光熱、土壤等自然條件，具備優(yōu)越的油橄欖生長環(huán)境。年平均氣溫14-18℃，極端最低溫度-7℃至-9℃，平均年降雨量500-1 000mm，平均相對濕度61%-69%，日照2 000-2 700h。于2017-2018年連續(xù)進(jìn)行了表型性狀的測定。材料編號、名稱、起源和用途見表1。

表1 油橄欖品種及其原產(chǎn)地

1.2 油橄欖表型性狀的測定

每個(gè)品種從樹冠南側(cè)齊肩高處，選取樹齡5年，一年生枝條8-10根，在枝條中部共取40片正常葉，參照國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)的《植物新品種DUS測試指南 油橄欖》TG/99/3 1985-11-13的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)測定葉片長度、葉片寬度、葉形指數(shù)、葉片厚度、葉周長共5個(gè)性狀指標(biāo)，其中葉形狀由葉形指數(shù)葉片長度(L)/葉片寬度(W)來確定：L/W<4為橢圓形；L/W=4-6為橢圓披針形；L/W>6為披針形。在果實(shí)成熟期，每株從同一部位最具代表性的結(jié)果枝的中部，選取發(fā)育正常并完成轉(zhuǎn)色的果共計(jì)40粒，測定果橫徑、果縱徑、單果重、果形狀、果肉率、果形指數(shù)共6個(gè)性狀指標(biāo)，其中果形狀由果形指數(shù)果實(shí)長度(L)/果實(shí)寬度(W)來確定：L/W<1.25為球形；L/W=1.25-1.45為卵形；L/W>1.45為細(xì)長形。剝?nèi)ス夂?，將果核洗凈、晾干，測定果核橫徑、核縱徑、單核重、核形指數(shù)、核形狀共5個(gè)表型性狀指標(biāo)，其中核形狀由核形指數(shù)核縱徑(L)/核橫徑(W)來確定：L/W<1.4為球形；L/W=1.4-1.8為卵圓形；L/W=1.8-2.2為橢圓形；L/W>2.2為細(xì)長形。

1.3 SSR標(biāo)記

2017年春季采集一年生枝條頂端幼嫩葉片，用植物基因組提取試劑盒(Tsingke生產(chǎn)，貨號TSP101-200)提取基因組DNA。從已發(fā)表的SSR引物中篩選出能在19個(gè)樣品中穩(wěn)定擴(kuò)增、多態(tài)性好的20對SSR引物(UDO99-001、UDO99-004、UDO99-012、UDO99-014、UDO99-015、GAPU59、DCA04、DCA09、DCA11、DCA16、DCA18、EMO02、EMO30、EMO90、GAPU59、GAPU71B、GAPU89、GAPU101、UDO24、UDO36)用于遺傳分析[15-16]。反應(yīng)體系15μL，擴(kuò)增程序94℃預(yù)變性5min；94℃預(yù)變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35次循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，吸取2μLPCR產(chǎn)物，加入6μL 1×loading buffer(Tsingke生產(chǎn)，貨號TSJ010)混勻，0.8%瓊脂糖凝膠(電壓：5V/cm，EB染色)電泳10-15min分離，電泳液緩沖液0.5×TBE。電泳結(jié)束后，凝膠成像儀紫外成像留影。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與遺傳分析

位點(diǎn)信息匯總在一個(gè)Excel表中，按照CONVERT 131軟件要求格式整理，轉(zhuǎn)換格式。用PopGene 32軟件計(jì)算各標(biāo)記的主要等位基因頻率、觀察等位基因數(shù)(na*)、有效等位基因數(shù)(ne*)、Shannon’s多樣性指數(shù)、期望雜合度(Nei**)和觀望雜合度。利用Population軟件計(jì)算遺傳距離因子，用鄰接法(NJ)繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 19個(gè)油橄欖品種表型性狀評價(jià)

不同油橄欖品種的表型數(shù)量性狀變異豐富，其變異系數(shù)為7.6%-51.85%，所測的19個(gè)油橄欖品種中，果實(shí)2個(gè)球形，7個(gè)卵形，10個(gè)細(xì)長，大多品種皮孔較少；葉2個(gè)披針形，1個(gè)橢圓形，其余16個(gè)均為橢圓披針形，19個(gè)品種油橄欖葉片有一個(gè)向上，18個(gè)葉片縱向平展。

表2 油橄欖14個(gè)表型數(shù)量性狀統(tǒng)計(jì)分析

基于14個(gè)表型數(shù)量性狀計(jì)算品種間的Eudidean距離，對19個(gè)油橄欖品種的NJ聚類分析結(jié)果(圖1)表明，19個(gè)油橄欖品種聚為2個(gè)組，其中第1大組又包括3個(gè)小組，第1大組的第1小組包括佛奧、皮瓜爾、貝拉、城固、阿斯；第2小組包括柯基、豆果、米扎、阿波薩納、云雜；第3小組組包括皮削利、萊星、科拉蒂、鄂植8號、卡林、配多靈、坦彩、小蘋果；第2大組為白橄欖。

圖1 油橄欖數(shù)量性狀分析聚類圖

2.2 基于油橄欖SSR標(biāo)記的多樣性及聚類分析

20個(gè)SSR位點(diǎn)在19個(gè)品種中的檢測結(jié)果(表3)，共檢測到124個(gè)等位基因變異，平均每個(gè)等位基因數(shù)為6.2個(gè)。其中DCA09、UDO24位點(diǎn)產(chǎn)生10個(gè)等位基因變異，UDO99-001、UDO99-004產(chǎn)生3個(gè)等位基因變異，最大等位基因頻率為0.631 6，多態(tài)信息量平均為0.646 4，Shannon’s指數(shù)H’平均為0.693 3，Shannon’s指數(shù)H’范圍在0.513 9-0.831 8之間，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

根據(jù)SSR標(biāo)記計(jì)算品種間的Jaccard系數(shù)，對19個(gè)油橄欖品種的NJ聚類分析結(jié)果(圖2)表明，19個(gè)油橄欖品種被分成3組，第1組包括阿波薩納、豆果、卡林；第2組包含坦彩、城固、貝拉等15個(gè)油橄欖品種；第3組為米扎。

表3 20對SSR引物的多態(tài)性分析

圖2 SSR標(biāo)記油橄欖聚類分析的無根NJ樹狀圖

3 結(jié)論與討論

本研究對云南麗江引種的19個(gè)油橄欖品種14個(gè)表型性狀和20個(gè)SSR標(biāo)記的多樣性分析表明，19個(gè)油橄欖品種具有較豐富的表型及遺傳多樣性，在本研究中選用的20對引物可完全把19個(gè)油橄欖品種區(qū)分開。表型性狀相似的品種需結(jié)合SSR標(biāo)記進(jìn)一步結(jié)合鑒定。

19個(gè)油橄欖品種葉片表型數(shù)量性狀(除葉型指數(shù)和葉厚)在品種內(nèi)具有較大的差異，這說明葉片表型性狀是不穩(wěn)定的。本文并未對表型數(shù)量性狀進(jìn)行多年分析比較，但葉片的大小和形態(tài)會(huì)隨著樹齡而變化，果實(shí)和果核的大小在“大小年”也存在很大的差異，所以表型數(shù)量性狀僅能作為品種鑒定的參考。此外，數(shù)量性狀與豐產(chǎn)性、抗性和“童期”長短相關(guān)，可以作為實(shí)生選優(yōu)早期鑒定的依據(jù)。

19個(gè)油橄欖品種表型性狀和SSR分子標(biāo)記具有較豐富的遺傳多樣性，其表型性狀變異系數(shù)具有一定的差異性，表型性狀相似的品種，其不一定具有親緣關(guān)系，所以表型性狀在聚類分析上應(yīng)結(jié)合SSR標(biāo)記進(jìn)行油橄欖品種的鑒定。