谷麗萍，鄭科，劉玉蓉,馬惠芬，肖支葉

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201；2.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

沉香十分珍貴，但是天然結(jié)香“百無一二”，導(dǎo)致人工結(jié)香逐漸盛行起來。由于真正高效的結(jié)香技術(shù)卻幾近空白，人們開始探索快速、高效的人工結(jié)香技術(shù)。人工結(jié)香主要集中在3個方面，一是物理誘導(dǎo)結(jié)香(半斷干、砍傷及鑿洞等技術(shù))，二是化學(xué)誘導(dǎo)(氯化鈉、亞硫酸氫鈉、氯化亞鐵等藥劑)，三是真菌誘導(dǎo)〔黃綠墨耳菌(Melanotusflavolivens)〕等[1]。本項研究使用國內(nèi)普遍采用且比較有效的結(jié)香真菌[2]可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)與腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)(沉香出產(chǎn)大國印尼采用的結(jié)香真菌)開展了白木香(Aquilariasinensis)接菌結(jié)香試驗，對白木香樹枝接菌前后木質(zhì)部的顯微構(gòu)造進(jìn)行觀察，確定白木香樹枝中形成的沉香樹脂的組織分布范圍以及在熒光下觀察被真菌侵染與未被真菌侵染的白木香內(nèi)含韌皮部的胼胝質(zhì)沉積情況，以探討真菌接種白木香的結(jié)香機(jī)理，為白木香人工結(jié)香提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

(1)液體菌劑制備與滴注 在無菌條件下，將擴(kuò)繁后的菌液分別用已滅菌的單層醫(yī)用紗布過濾，棄掉培養(yǎng)基，留下濾液。此濾液中含有真菌的菌絲體。將可可毛色二孢和腐皮鐮孢菌體分裝到預(yù)先滅菌并稱重的離心管中，室溫下10 000rpm離心3min，倒棄上清液，保留沉淀物，并稱量離心后的離心管總重，計算出菌體濕重。由于實驗條件所限，在超凈工作臺上分別稱可可毛色二孢1g、3g(記為L1、L3)，腐皮鐮孢菌2g、3g、4g(記為F2、F3、F4)，混菌(每個菌0.5g、1g，記為H1、H2)轉(zhuǎn)入新的離心管中，在組織研磨儀中研碎。之后分別用少量純凈水將不同濕重的菌溶分裝到貼有標(biāo)簽的輸液袋(含輸液管、輸液針頭和流速調(diào)節(jié)裝置)中，再加入1 000mL純凈水制成不同濃度的液體菌劑。

在景洪市勐?？h勐宋鄉(xiāng)廣順沉香基地，選取白木香樹，在白木香較大樹干10-50cm部位，用電鉆在樹枝兩側(cè)鉆出深約5cm的輸液孔(直徑5mm)，輸液孔與地面成30°-45°夾角。輸液袋掛在高于接菌處的樹枝上，將輸液針頭插入輸液孔，調(diào)節(jié)流速至營養(yǎng)液流動但不外溢，將各處理液體菌劑輸入到白木香較大樹枝中，其液約2d滴注完成。每個處理3株，即3次重復(fù)。

(2)實驗材料 真菌侵染白木香樹5月后，從接菌處用手工鋸截斷白木香樹枝，再用砍刀取木質(zhì)部結(jié)香處，將形成樹脂的木質(zhì)部作為樣品。

(3)試劑與設(shè)備 1%番紅染色劑，苯胺藍(lán)染色液，正丁醇，二甲苯，體積分?jǐn)?shù)50%、75%、95%乙醇，無水乙醇，聚乙二醇(分子量1 500)，病理級載玻片與蓋玻片，萊卡劃走式切片機(jī)，砍刀，烘箱，尼康80i生物數(shù)碼顯微鏡。

1.2 實驗方法

(1)樣品固定 對樣品去掉腐木部分，樣品含過渡帶與白木部分。取樣后將樣品迅速放入FAA固定液(50%酒精90mL+福爾馬林5mL+冰醋酸5mL)中固定。

(2)切片制備 a.包埋前用自來水將FAA固定液固定的樣品沖洗5min，除去殘留的FAA固定液。隨后用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%和100%的PEG依次包埋24h;b.樣品包埋完成后，用萊卡劃走式切片機(jī)進(jìn)行切片，切片制作2份。將1份切片平展于載玻片上，同時用蓋玻片封好，轉(zhuǎn)入1%番紅染色劑中染色2h。染色完成后，將樣品依次放入體積分?jǐn)?shù)為50%、75%、95%乙醇中脫水，每次脫水5min;c.將b中在95%乙醇中脫水完成的切片放入固綠染液復(fù)染1min，依次在無水乙醇和正丁醇中沖洗5min，然后在正丁醇、1/2正丁醇+1/2二甲苯和二甲苯中依次處理5min，完成復(fù)染后封片并于50℃烘箱中烘片24h;d.采用苯胺藍(lán)染色法，將另外1份切片置于苯胺藍(lán)溶液中，染色30min，取出平展于載玻片上，同時用蓋玻片封好。用尼康80i生物數(shù)碼顯微鏡(熒光組件)在紫外光激發(fā)下觀察胼胝質(zhì)沉積情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 白木香樹枝解剖構(gòu)造

白木香接菌結(jié)香后相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1未滴注和滴注H2菌劑5月后白木香的微觀構(gòu)造

注：1為未被真菌侵染的白木香樹枝的橫切面構(gòu)造，沒有沉香樹脂

形成；2為未被真菌侵染的白木香樹枝的弦切面構(gòu)造，沒有沉香樹脂形成；3為未被真菌侵染的白木香樹枝的徑切面構(gòu)造，沒有沉香樹脂形成；4為H2侵染后的橫切面構(gòu)造，圖中導(dǎo)管壁、木射線和內(nèi)含韌皮部中均形成沉香樹脂；5為H2侵染后的弦切面構(gòu)造，圖中導(dǎo)管壁和木射線細(xì)胞中有沉香樹脂；6為H2侵染后的徑切面構(gòu)造，圖中木射線細(xì)胞中和內(nèi)含韌皮部產(chǎn)生大量沉香樹脂。

Fig.1 The microstructure ofA.sinensisafter 5 months treatment without or with microbial inoculums drip(H3)

由圖1可以看出，白木香樹枝生長輪不明顯，散孔材。導(dǎo)管橫切面為圓形或卵圓形，單管孔較多，多數(shù)導(dǎo)管常2-4個排列為徑列復(fù)管孔或為管孔團(tuán)。木纖維細(xì)長，壁薄。木射線非疊生，單列及多列，射線組織異型III型，少數(shù)II型，正常射線細(xì)胞不含樹膠。內(nèi)含韌皮部甚多，四周為薄壁組織，呈多孔型(島型)，細(xì)胞壁薄，在次生木質(zhì)部內(nèi)呈條帶狀或長橢圓狀均勻分布。內(nèi)含韌皮部中的木射線薄壁細(xì)胞和木纖維細(xì)胞，經(jīng)番紅固綠雙染色后呈綠色。

2.2 白木香樹枝沉香樹脂分布

白木香樹枝被結(jié)香真菌侵染5月后，接菌口上下木質(zhì)部均發(fā)生病腐。從可可毛色二孢、腐皮鐮孢菌和復(fù)合菌侵染白木香其樹枝的顯微構(gòu)造能夠看出，沉香樹脂主要出現(xiàn)在導(dǎo)管、木射線薄壁細(xì)胞和內(nèi)含韌皮部。從切片上觀察發(fā)現(xiàn)，樹脂剛產(chǎn)生時附著在導(dǎo)管壁和薄壁細(xì)胞壁上，隨著侵染時間延長，樹脂沉積在導(dǎo)管中，薄壁細(xì)胞則被樹脂填充，最終失去生理活性。導(dǎo)管和木射線在木材中分別主導(dǎo)徑向和橫向輸送養(yǎng)分的作用[3]，薄壁細(xì)胞是邊材儲存養(yǎng)分的生活細(xì)胞，沉香樹脂主要出現(xiàn)在導(dǎo)管、木射線薄壁細(xì)胞和內(nèi)含韌皮部，可能與其輸送和儲存養(yǎng)分的功能有關(guān)聯(lián)。在可可毛色二孢和腐皮鐮孢菌侵染的白木香中，低濃度菌液處理條件下，樹脂產(chǎn)生部位主要在導(dǎo)管壁上，木射線薄壁細(xì)胞和內(nèi)含韌皮部薄壁細(xì)胞中樹脂甚少。隨著菌液濃度增大，到3g/L時此二者細(xì)胞中均形成了樹脂。在混菌接種白木香處理條件下，菌液濃度為1g/L 和2g/L時(圖1)，白木香在導(dǎo)管、木射線細(xì)胞和內(nèi)含韌皮部形成大量樹脂，已看不清木射線薄壁細(xì)胞形態(tài)，薄壁細(xì)胞失去了生理活性。圖1為未被真菌侵染的白木香樹枝和復(fù)合菌劑H2侵染白木香5月后其樹枝的解剖構(gòu)造。

2.3 真菌侵染對白木香胼胝質(zhì)沉積的影響

利用尼康80i生物數(shù)碼顯微鏡在紫外光激發(fā)下，觀察經(jīng)苯胺藍(lán)溶液染色的樣品切片的胼胝質(zhì)沉積情況并拍照。胼胝質(zhì)分布情況見圖2。

胼胝質(zhì)(callose)是一種以β-1,3鍵結(jié)合的葡聚糖，圍繞每個篩孔的邊緣積累。胼胝質(zhì)可及時合成和降解來應(yīng)答外界的物理、化學(xué)和生物入侵引起的生物脅迫[4]，它的合成能夠增強植物的抗病性。通過對樣品切片的熒光顯微觀察，發(fā)現(xiàn)白木香內(nèi)含韌皮部中的胼胝質(zhì)呈顆粒狀。白木香產(chǎn)生沉香樹脂的地方未見或有較少胼胝質(zhì)分布，在過渡帶部分，內(nèi)含韌皮部四周的薄壁組織壁異常發(fā)亮，在F2、F3、F4、L1、L3、H1和H2處理方式下十分明顯，內(nèi)含韌皮部篩管中有較多胼胝質(zhì)分布。還未產(chǎn)生沉香樹脂的地方有較多的胼胝質(zhì)沉積。在一個內(nèi)含韌皮部中，可觀察到兩個及以上胼胝質(zhì)，在熒光下呈黃綠色亮斑，處于過渡帶的胼胝質(zhì)色澤偏淺，可能是其參與白木香的抗病反應(yīng)而被消耗。在組織感病附近，胼胝質(zhì)沉積較多，說明白木香樹在受到傷害的情況下，會在受害組織細(xì)胞及附近迅速沉積大量胼胝質(zhì)以愈合傷口。本研究發(fā)現(xiàn)，無論何種處理方式，白木香內(nèi)含韌皮部中的胼胝質(zhì)均呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律。圖2為F2、F3、F4、L1、L3、H1、H2和未感菌的白木香橫切面胼胝質(zhì)分布圖。

圖2接菌和未接菌的白木香木材橫切面的胼胝質(zhì)分布

注：L1為可可毛色二孢1g；L3為可可毛色二孢3g；F2為腐皮鐮

孢菌2g；F3為腐皮鐮孢菌3g；F4為腐皮鐮孢菌4g；H1為混菌，每個菌0.5g；H2混菌，每個菌1.0g。

Fig.2 Callose distribution on the cross section ofA.sinensisinoculated and un-inoculated fungi

2.4 真菌侵染結(jié)香機(jī)理分析

目前，關(guān)于白木香結(jié)香機(jī)制的研究仍然集中于真菌侵染誘導(dǎo)結(jié)香，機(jī)理尚不明確[5]。在自然條件下，植物經(jīng)常處在生物與非生物脅迫之中。真菌侵染白木香的過程是病原菌對其施加生理脅迫的過程。在生理脅迫過程中，植物細(xì)胞會通過產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)來抵御脅迫。馬華明[3]研究了2種結(jié)香效果不同的結(jié)香菌株[層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)和紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)]對白木香組培幼苗的生理脅迫過程，通過比較它們之間的異同點來分析脅迫與結(jié)香之間關(guān)系。分析結(jié)香真菌與糖代謝的聯(lián)系發(fā)現(xiàn)，真菌侵染后會引發(fā)植物可溶性糖的大幅增加，可能引發(fā)植物生長素的連鎖反應(yīng)。由此可知，植物體內(nèi)的糖作為一種信號分子存在，和其它信號分子一起組成植物的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)體系，增強植物對逆境脅迫的抵抗性。糖的代謝是整個植物代謝的中心，調(diào)節(jié)著植物的一系列生命活動。研究發(fā)現(xiàn)，植物對糖信號的感知和傳導(dǎo)可在毫摩爾水平進(jìn)行[6]，這與植物體內(nèi)的一種超細(xì)胞結(jié)構(gòu)—胞間連絲[7]的存在有關(guān)。糖在沉香形成中或許具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在各處理條件下，在白木香組織發(fā)生病腐處形成樹脂，在感病附近有胼胝質(zhì)沉積，但沉積數(shù)量有差異。胼胝質(zhì)的沉積受到β-1,3葡聚糖酶的控制[8]，β-1,3葡聚糖酶活性存在差異，使胼胝質(zhì)沉積速度不同。胼胝質(zhì)在真菌侵染部位富集，會持續(xù)合成與分解，具有可逆性，胼胝質(zhì)的合成與分解是一種糖代謝活動。與未感菌的白木香比較可知，感菌的白木香中胼胝質(zhì)的代謝更為活躍，沉積量比健康的白木香多。胼胝質(zhì)的沉積可改變篩管的運輸功能，也會改變細(xì)胞及溶液的滲透勢，使細(xì)胞中的水分含量發(fā)生變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物抗協(xié)迫環(huán)境的能力。真菌侵染白木香后，白木香樹應(yīng)答生物脅迫，在內(nèi)含韌皮部沉積的胼胝質(zhì)和其他信號分子進(jìn)行代謝，這個過程中，信號分子可能與病原菌產(chǎn)生的毒素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，以抵抗病原菌的病腐?；蛟诎g連絲處大量沉積，阻止病原菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物(小分子物質(zhì))在細(xì)胞間流通，降低細(xì)胞中的水分含量，形成不利于病原菌生長的環(huán)境，從而起到抑制真菌生長的作用。

3 結(jié)語

不同接菌處理白木香樹枝經(jīng)過5個月后，其導(dǎo)管、木射線薄壁細(xì)胞和內(nèi)含韌皮部組織中均會形成沉香樹脂。在木質(zhì)部形成沉香樹脂阻塞木射線和內(nèi)含韌皮部薄壁細(xì)胞，阻止水分遷移。結(jié)香真菌侵染白木香引起其組織局部壞死反應(yīng)，進(jìn)而促使胼胝質(zhì)積累以應(yīng)答病原真菌引起的植物逆境脅迫。在已形成沉香樹脂的地方未見胼胝質(zhì)沉積，在過渡帶有許多胼胝質(zhì)沉積。胼胝質(zhì)沉積堵塞篩板，阻止水分遷移，胼胝質(zhì)參與了防御反應(yīng)以及沉香樹脂的形成過程。糖在白木香沉香形成中或許具有重要作用。

人們只有在弄清結(jié)香機(jī)理，攻克結(jié)香技術(shù)的基礎(chǔ)上，才會提高沉香產(chǎn)量，沉香樹種植產(chǎn)業(yè)也才會得到大力發(fā)展。本次研究揭示了可可毛色二孢與腐皮鐮孢菌侵染白木香樹體后，會促使樹體產(chǎn)生樹脂以及胼胝質(zhì)以抵御真菌的侵染，相應(yīng)產(chǎn)生一些沉香類物質(zhì)。但是真菌侵染損害樹體如何導(dǎo)致沉香活性次生代謝物的產(chǎn)生涉及其各個機(jī)理仍然不清楚，此外，除真菌損傷外，其他損害(物理損傷、化學(xué)損傷)如何導(dǎo)致白木香樹沉香類物質(zhì)產(chǎn)生仍需進(jìn)一步探討。