，，

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004；2.安康市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，陜西 安康725000)

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率占女性癌癥發(fā)病率的第二位，并且呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。每年全球?qū)m頸癌的新發(fā)病例可高達(dá)50萬(wàn)人，每年有超過(guò)27萬(wàn)女性死于宮頸癌[2]。雖然近年來(lái)癌癥診療水平提高，宮頸癌的病死率有所降低，但仍是導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家女性死亡的重要原因[3]。腹腔鏡手術(shù)是目前治療宮頸癌的最主要方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然較高[4]。研究表明，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌復(fù)發(fā)的重要原因[5]。因此，有效減少手術(shù)過(guò)程中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可能有利于降低宮頸癌的復(fù)發(fā)率。右美托咪啶(dexmede-tomidine,Dex)是一類脂溶性的α2腎上腺素激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、止痛及血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，是臨床常用的手術(shù)麻醉輔助用藥[6-7]。有研究表明，嗎啡、丙泊酚等麻醉藥會(huì)影響癌癥的發(fā)展[8-9]。還有研究發(fā)現(xiàn)Dex也能調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，但Dex對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力的影響還未見(jiàn)報(bào)道[10]。因此，本文采用不同濃度的Dex處理宮頸癌Hela細(xì)胞，以探究Dex對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Dex購(gòu)自江西恒瑞醫(yī)藥公司 (生產(chǎn)批號(hào)：13120134)。人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。CCK8試劑盒、Hoechst染色劑和RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶生物公司；Transwell小室和Matrigel購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。Ki67、Caspase-3、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、磷酸肌醇3激酶(phosphatidy inositol 3-kinase,PI3K)、p-PI3K、Akt和p-Akt一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京博奧森生物公司。

1.2 細(xì)胞分組及給藥

用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將人宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為Hela組、Dex(1 μM) 組、Dex(2 μM) 組和Dex(5 μM) 組，每組6個(gè)復(fù)孔，并分別加入0，1，2，5 μM的Dex處理細(xì)胞，24 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，接種密度為1×104個(gè)/mL。待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞隨機(jī)分為Hela組、Dex(1 μM) 組、Dex(2 μM) 組和Dex(5 μM) 組，加入相應(yīng)濃度的Dex分別處理0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后，根據(jù)CCK8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞活性。

1.4 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將用不同濃度Dex處理后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，并用磷酸鹽緩沖液清洗3次，加入4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，隨后棄去多聚甲醛并洗凈，加入少量Hoechst染色液，以覆蓋底部細(xì)胞為宜，室溫染色30 min后，棄染色液，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將Hela細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于Transwell小室上層，并用含有不同濃度Dex的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，小室下層則加入正常培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后用結(jié)晶紫對(duì)侵襲到小室下層的細(xì)胞進(jìn)行染色，于顯微鏡下拍照記錄。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

實(shí)驗(yàn)前用滅菌的Maker筆于12孔板背面每孔劃5條平行直線，滅菌后備用。將細(xì)胞接種于12孔空板內(nèi)，密度為1×105個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁后，用10 μL的槍頭垂直于培養(yǎng)板背面直線劃痕，用緩沖液洗去懸浮細(xì)胞，將培養(yǎng)液更換為含有不同濃度Dex的無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于0 h和24 h拍照記錄，計(jì)算各組細(xì)胞的劃痕閉合率 ，劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞總蛋白濃度并調(diào)平，取等量蛋白用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并采用半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，加入5% BSA室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，隨后加入一抗于4 ℃封閉過(guò)夜。第2天用緩沖液洗去未結(jié)合一抗，加入二抗室溫孵育1 h后，洗去未結(jié)合二抗并滴加化學(xué)發(fā)光顯色液于暗室曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參，用ImageJ對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Dex對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

用Dex處理細(xì)胞4 d后，與Hela組細(xì)胞比較，Dex(1 μM)組、Dex(2 μM) 組和Dex(5 μM)組細(xì)胞增殖速度均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖1；同時(shí)，Dex(1,2,5 μM) 組細(xì)胞凋亡率也顯著高于Hela組(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，進(jìn)一步表明Dex能抑制Hela細(xì)胞存活(圖2)；此外，Dex(1,2,5 μM)還能顯著降低Hela細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)水平(P<0.01)，升高細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的蛋白表達(dá)水平 (P<0.05，P<0.01，P<0.01)，進(jìn)一步表明Dex能抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)(圖3)。

*:與Hela組比較，P<0.5；#:與Hela組比較,P<0.01

2.2 Dex對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Dex(1,2,5 μM) 能抑制p-PI3K和p-Akt的表達(dá)，顯著降低p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值(P<0.01)，并隨濃度升高作用逐漸增強(qiáng)，表明Dex能抑制Hela細(xì)胞PI3K/Akt通路的激活(圖4)。

2.3 Dex對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

與Hela組比較，Dex(1,2,5 μM)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，并具有量效關(guān)系(P<0.01)，見(jiàn)圖5；如圖6所示，Dex(2,5 μM)還能顯著抑制Hela細(xì)胞遷移(P<0.01)，提示Dex能降低Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；此外，Dex(1,2,5 μM)還能顯著降低Hela細(xì)胞VEGF的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，進(jìn)一步表明Dex具有抑制Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力(圖3)。

a:Hoechst染色結(jié)果；b:細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì) *:與Hela組比較，P<0.05;#:與Hela組比較，P<0.01

a:Western blot圖片；b:蛋白表達(dá)水平 *:與Hela組比較，P<0.05;#:與Hela組比較，P<0.01

圖3Dex對(duì)Ki67、Caspase-3和VEGF表達(dá)的影響

a:Western blot圖片；b:蛋白表達(dá)水平 *:與Hela組比較，P<0.01

a:結(jié)晶紫染色結(jié)果；b:細(xì)胞侵襲數(shù)目統(tǒng)計(jì) *:與Hela組比較，P<0.01

a:劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果；b:劃痕閉合率 *:與Hela組比較，P<0.01

3 討論

宮頸癌是導(dǎo)致女性死亡的主要原因之一，雖然目前有很多抗癌的新藥和方法能減緩宮頸癌的發(fā)展，但其副作用使癌癥患者的生活質(zhì)量下降，且病死率并未出現(xiàn)降低的趨勢(shì)[11]。手術(shù)切除是臨床治療癌癥的常用方法，手術(shù)期是影響癌癥預(yù)后的一個(gè)重要時(shí)期[12]。近年來(lái)的研究表明，手術(shù)期的操作不當(dāng)會(huì)增加癌癥的術(shù)后復(fù)發(fā)率，同時(shí)，麻醉藥的正確使用能有效降低手術(shù)期間癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。Zhang等[15]的研究表明，麻醉藥物丙泊酚能有效抑制乳腺癌MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞系細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因1的表達(dá)，還能通過(guò)調(diào)控mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡[16]。Dex是臨床常用的麻醉輔助用藥，能增強(qiáng)布比卡因等麻醉藥物的麻醉效果,并能有效降低其副作用，但其對(duì)癌癥的作用還較少見(jiàn)報(bào)道[17]。本研究采用不同濃度的Dex處理人宮頸癌Hela細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力以探究Dex對(duì)宮頸癌的作用。

細(xì)胞無(wú)限增殖及凋亡抑制是導(dǎo)致癌癥發(fā)生及發(fā)展的主要原因。抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是目前癌癥化療和放療的主要機(jī)制，抑制癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡能有效減緩癌癥的發(fā)展，延長(zhǎng)癌癥患者的存活時(shí)間[18]。研究表明，Dex能通過(guò)抑制p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路激活提高卵巢癌大鼠的自身免疫功能，從而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化，提示Dex可能具有一定的抗癌活性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，用Dex處理Hela細(xì)胞4 d后，Hela細(xì)胞增殖速度明顯降低，并隨Dex濃度的升高作用逐漸增強(qiáng)。Ki67是細(xì)胞增殖有絲分裂期間表達(dá)的一類蛋白，因此常被用作細(xì)胞增殖的標(biāo)志性蛋白[20]。本研究顯示，Dex還能顯著抑制細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)，提示Dex能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖。此外，Dex還能顯著增加Hela細(xì)胞的凋亡率，并上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，表明Dex能促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡，從而降低宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。

癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥惡化和術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)的主要原因。據(jù)報(bào)道，出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的患者5年生存率僅有25%，因此有效降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力是降低癌癥復(fù)發(fā)率和減緩癌癥惡化的關(guān)鍵[21]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是由多種細(xì)胞因子調(diào)控的過(guò)程，如基質(zhì)金屬蛋白酶、VEGF等[22]。其中VEGF是血管新生相關(guān)蛋白，能夠促進(jìn)新血管的形成。研究表明，新血管形成是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的第一步，新形成的血管能為轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分[23]。此外，VEGF還能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，因此常被作為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的標(biāo)志蛋白[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，Dex能降低Hela細(xì)胞VEGF的表達(dá)水平，同時(shí)還能顯著減少侵襲細(xì)胞，降低Hela細(xì)胞的劃痕閉合率，提示Dex能抑制Hela細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而降低Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

PI3K/Akt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化和轉(zhuǎn)移的重要信號(hào)通路之一。同時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)控癌細(xì)胞及腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用[25]。抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，從而減緩宮頸癌的發(fā)展[26]。研究表明，Dex能通過(guò)促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活對(duì)抗缺血引起的腦損傷及肺損傷[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，Dex能抑制Hela細(xì)胞p-PI3K和p-Akt的表達(dá)，降低p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值，表明Dex能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。

綜上所述，Dex能降低Hela細(xì)胞的增殖速度和Ki67的表達(dá)水平，增加Hela細(xì)胞凋亡率和Caspase-3的表達(dá)水平；同時(shí)，Dex能降低Hela細(xì)胞侵襲數(shù)和劃痕閉合率，降低VEGF的表達(dá)水平；此外，Dex還能降低p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值，表明Dex可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活抑制Hela細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡，從而降低Hela細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移能力。本研究探討了Dex對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的作用，可能為降低宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)率提供了一種新的潛在藥物。