安志遠(yuǎn)， 丁文一， 鄭春明， 黃驍舾

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心， 北京 100020； 2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科， 北京 100730)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種重要的臨床機(jī)會(huì)致病菌，可以引起呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、敗血癥和泌尿道感染等感染性疾病。近年來臨床上出現(xiàn)了多耐藥及泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，給治療帶來極大困難[1-3]。目前已知鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白在其引起細(xì)胞毒性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[4-6]，其中外膜蛋白A(outer membrane protein A，OmpA)是鮑曼不動(dòng)桿菌主要毒力蛋白，它可以導(dǎo)致包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子及引發(fā)凋亡[7-8]。但其是否可以引起宿主細(xì)胞自噬還不清楚。

自噬是機(jī)體應(yīng)對(duì)應(yīng)激和感染等外界不利因素，吞噬降解胞質(zhì)中受損的細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程[9]。自噬的發(fā)生和發(fā)展需要多種自噬蛋白共同完成，其中LC3對(duì)于自噬的活化至關(guān)重要，自噬體膜形成的過程中，胞漿中的LC3-I會(huì)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成的共軛LC3的磷脂酰乙醇胺，即LC3-II，它是自噬體活化的分子標(biāo)志[10]。研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌及其毒力因子可以引起細(xì)胞自噬，自噬作用對(duì)于細(xì)胞清除細(xì)菌感染起到積極作用[11-12]。2016年，Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌可以引起HeLa細(xì)胞自噬，但卻不清楚是何種毒力因子引發(fā)的自噬。本實(shí)驗(yàn)室先前通過構(gòu)建OmpA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞過表達(dá)OmpA，證實(shí)其可以引起HeLa細(xì)胞自噬[14]，但到目前還不知道OmpA是否可以引起宿主免疫細(xì)胞自噬，為了進(jìn)一步證實(shí)OmpA對(duì)免疫細(xì)胞的自噬作用及具體的分子機(jī)制，本研究將分析鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA對(duì)RAW264.7細(xì)胞的自噬作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC? 19606TM)的OmpA由本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化；抗LC3A/B、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K和β-actin抗體購自CST；雷帕霉素(rapamycin，Rapa)購自Sigma；抗兔熒光II 抗購自中杉金橋生物公司；RIPA細(xì)胞裂解液購自Beyotime。蛋白質(zhì)電泳儀(Bio-Rad)；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(Leica)；HT7700透射電子顯微鏡(Hitachi)；其余試劑為進(jìn)口和國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(ATCC?TIB-71TM)購自美國模式菌種保藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素購自Gibco。細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清和1%青、鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

2.2Western blot分析 分別收集10 mg/L OmpA刺激不同時(shí)間(0、6、12和24 h)或用5和10 mg/L OmpA刺激24 h的RAW264.7細(xì)胞，PBS緩沖液潤洗3次，用RIPA裂解液在冰上裂解細(xì)胞20 min，12 000×g離心10 min收集蛋白上清備用。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。用10%或15% SDS-PAGE，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 μm或0.45 μm的PVDF膜(Merck Millipore)上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，剪下目的條帶并和相應(yīng)的 I 抗在4 ℃孵育過夜，隔天TBST洗膜3次，每次10 min,之后與熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體或山羊抗小鼠抗體(1∶15 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次,每次10 min，再用Odyssey? CLx成像系統(tǒng)(LI-COR Bioscences)檢測(cè)蛋白表達(dá)，最后用ImageJ軟件分析灰度值。

2.3透射電子顯微鏡觀察自噬體 RAW264.7細(xì)胞以5×104的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后用10 mg/L OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞24 h，300×g離心5 min收集細(xì)胞沉淀，用2.5%的戊二醛在4 ℃下固定2 h，PBS洗3遍；用1%的鋨酸室溫固定2 h，PBS洗3遍；用梯度乙醇(50%、70%、80%、90%,每步10 min)對(duì)細(xì)胞組織進(jìn)行脫水、滲透。將組織放入環(huán)氧樹脂中包埋，之后用超薄切片機(jī)(Leica)將細(xì)胞組織切割成70 nm厚度，最后用醋酸鈾和硝酸鉛染色。將制備好的切片用透射電子顯微鏡獲取高分辨率圖像。

2.4細(xì)胞免疫熒光染色 將10 mg/L OmpA刺激24 h的RAW264.7細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，之后加入0.3% Triton X-100通透10 min，3% BSA室溫封閉1 h，之后加入抗LC3A/B抗體，4 ℃孵育過夜，之后用PBS洗3次，每次5 min,加入抗兔熒光 II 抗室溫孵育1 h，細(xì)胞核用1 mg/L DAPI染色，圖像用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖，用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，差異顯著性用Student’st-test或用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序隨后進(jìn)行Bonferroniposthoctest分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA引起RAW264.7細(xì)胞自噬

細(xì)胞免疫熒光顯示,10 mg/L的OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生了大量的LC3熒光斑點(diǎn)狀聚集，而未處理組未觀察到LC3熒光斑點(diǎn)狀聚集，見圖1A。Western blot結(jié)果顯示，OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞6 h后可使LC3B-II表達(dá)升高，24 h時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰，說明OmpA引起RAW264.7細(xì)胞自噬具有時(shí)間依賴性，量化統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OmpA刺激組中的LC3B-II表達(dá)量隨著時(shí)間延長而逐漸增高，與未刺激組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖1B。最后我們通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)OmpA可以導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生典型的雙層囊泡類似洋蔥皮樣結(jié)構(gòu)的自噬小體(黑色箭頭所示)，而未處理組中細(xì)胞形態(tài)完整，各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，沒有發(fā)生自噬現(xiàn)象,見圖1C。

Figure 1.OmpA triggered autophagy in RAW264.7 cells. A: confocal microscopic detection of LC3 levels in 10 mg/L OmpA-stimulated or control RAW264.7 cells for 24 h (scale bar=10 μm); B: RAW264.7 cells were stimulated with 10 mg/L OmpA for 0 h, 6 h,12 h and 24 h,and the expression level of LC3B was detected by Western blot; C: transmission electron microscopy showed that 10 mg/L OmpA stimulate RAW264.7 cells for 24 h to induce autophagosome formation (the black arrows indicated typical autophagosomes; the scale bar of C1 and C2=1 μm; the scale bar of C3=200 nm). Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs 0 h.

2 鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA通過Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路引起RAW264.7細(xì)胞自噬

為了知道OmpA激活RAW264.7細(xì)胞自噬的具體信號(hào)途徑，我們檢測(cè)了自噬通路中mTOR分子及其上游分子Akt和下游分子p70S6K的磷酸化改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mg/L的OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間(0、6、12和24 h)后可以引起Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化水平降低，具有時(shí)間依賴性，量化統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpA刺激組中Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化隨著時(shí)間延長而逐漸降低，與未刺激組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖2A。不同濃度(0、5和10 mg/L)的OmpA刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后也可引起Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化降低，具有劑量依賴性,量化統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化隨著OmpA刺激濃度的增高而逐漸降低，與未刺激組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖2B。另外，我們用mTOR的特異性抑制劑rapamycin(400 nmol/L)預(yù)先作用RAW264.7細(xì)胞6 h，之后用10 mg/L濃度的 OmpA刺激24 h后檢測(cè)mTOR和p70S6K的磷酸化及LC3B表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpA和rapamycin共孵育的RAW264.7細(xì)胞中mTOR和p70S6K的磷酸化程度比單純OmpA刺激組進(jìn)一步降低，而LC3B-II的表達(dá)水平比單純OmpA刺激組顯著提高(P<0.01)，證明OmpA通過Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路誘導(dǎo)了RAW264.7細(xì)胞自噬，見圖2C。

討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌的OmpA在其對(duì)宿主細(xì)胞的毒性中發(fā)揮著重要作用，但到目前對(duì)OmpA的研究和認(rèn)識(shí)僅僅局限在其對(duì)宿主細(xì)胞的凋亡作用，而OmpA侵襲宿主導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的同時(shí)是否還涉及其他信號(hào)分子我們還不清楚，因此本研究以免疫學(xué)中經(jīng)典的RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，分析了OmpA對(duì)其自噬及相關(guān)信號(hào)通路的影響。

鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA可以引起RAW264.7細(xì)胞LC3B-II表達(dá)水平增高，LC3B-II是自噬體形成的標(biāo)志蛋白，其表達(dá)強(qiáng)度越高說明自噬水平越強(qiáng)[15]，這與我們先前在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)OmpA所得到的結(jié)果相似，但OmpA是激活了哪條信號(hào)通路引起自噬的還不清楚。現(xiàn)在已知Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路是調(diào)節(jié)自噬激活的關(guān)鍵分子，自噬發(fā)生時(shí)mTOR的活性會(huì)受到上游分子Akt的抑制，其磷酸化水平會(huì)降低；而p70S6K是mTOR下游的效應(yīng)蛋白，mTOR磷酸化降低時(shí)其磷酸化水平也會(huì)相應(yīng)降低；相反這些分子的磷酸化升高會(huì)抑制自噬[16-17]。我們發(fā)現(xiàn)OmpA引起RAW264.7細(xì)胞LC3B-II表達(dá)升高的同時(shí)還明顯抑制了Akt、mTOR和p70S6K磷酸化水平；而且自噬激活劑rapamycin可以進(jìn)一步抑制mTOR和p70S6K磷酸化水平并提高OmpA引起的LC3B-II表達(dá)，這提示OmpA可能是通過下調(diào)Akt/mTOR/p70S6K磷酸化水平來激活自噬的。

Figure 2.OmpA induced autophagy in RAW264.7 cells through Akt/mTOR/p70S6K signaling pathway. A: the phosphorylation levels of Akt, mTOR and p70S6K in the RAW264.7 cells treated with 10 mg/L OmpA for 0 h, 6 h, 12 h and 24 h were detected by Western blot; B: RAW264.7 cells were stimulated with 0, 5 and 10 mg/L OmpA for 24 h, and the protein levels of p-Akt, p-mTOR and p-p70S6K were detected by Western blot analysis; C: the RAW264.7 cells were treated with 400 nmol/L rapamycin (Rapa) for 6 h before co-stimulaton with 10 mg/L OmpA for 24 h, and Western blot was used to detect the protein levels of LC3B-II, p-mTOR and p-p70S6K. Mean±SEM. n=3. *P<0.05, ** P<0.01 vs control group (0 h or 0 mg/L); ##P<0.01 vs OmpA group.

本研究證實(shí)鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA通過Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞自噬，這為將來進(jìn)一步研究鮑曼不動(dòng)桿菌引起自噬的分子機(jī)制及找到對(duì)抗其感染的新方法提供理論依據(jù)。